2018 Fiscal Year Annual Research Report
Mechanism and function of posttranslational modification zones
| Project Area | Toward an integrative understanding of functional zones in organelles |
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| Project/Area Number |
17H06421
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| Research Institution | Rikkyo University |
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Principal Investigator |
後藤 聡 立教大学, 理学部, 教授 (60280575)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
石川 裕之 千葉大学, 大学院理学研究院, 准教授 (00398819)
金川 基 神戸大学, 医学研究科, 講師 (00448044)
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| Project Period (FY) |
2017-06-30 – 2022-03-31
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| Keywords | オルガネラ・ゾーン / ゾーン形成因子 / GPI / ゴルジ体キナーゼ / ジストログリカン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は糖鎖やリン酸修飾を司るゾーンの分子基盤の解明を行った。
（１）GPI修飾ゾーンの分子基盤を解明するために、GPI修飾ゾーンに局在するPig-B, Transamidase complex (TAC) それぞれに結合するタンパク質を網羅的に同定した。同定したタンパク質のノックダウンを行ったところ、PIG-Bのゾーン局在に必要な因子としてB-type Laminを見つけることができた。TACの局在に必要な因子として複数の意外なタンパク質を見つけることができた。また、PIG-Bの表現型の詳細な解析より、核内の染色体領域ゾーンの形成にも関与している可能性が見出された（後藤）。
（２）ゴルジ体キナーゼFour-jointed（Fj）は、ショウジョウバエの発生に重要な役割をはたしている。本年度は、Fjの自己リン酸化はリン酸修飾ゾーン形成に必要な要素のひとつである可能性を示した。さらに、Fjの局在化因子を同定するために、Fjの細胞内局在を解析する実験系を構築し、RNAiスクリーンを開始した。また、リン酸修飾ゾーンが形成される細胞株を同定し、RNA-seqデータの比較からリン酸修飾ゾーン形成因子の新たな候補遺伝子を得ることができた。（石川）。
（３）ジストログリカンの修飾ゾーンを解析するために、PTAR1欠損細胞の網羅的糖鎖解析を実施したところ、ジストログリカンのみならず、グリコサミノグリカンや糖脂質の膜発現が低下していることが明らかになった。一方で、N型糖鎖やO型糖鎖のプロファイリングに大きな変動は観察されなかった。このことは、PTAR1がグリコサミノグリカンや糖脂質の選別輸送に選択的に関わっていることが示唆される。その機序を明らかにするためPTAR1結合分子を探索したところ、geranylgeranyl transferase type II beta-subunitが検出されたことから、Rabタンパクの制御を介して選別輸送に関わることが示唆された（金川）。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、ゾーンに局在するタンパク質の局在を決めるタンパク質、またはその候補タンパク質をそれぞれの系で同定することができたため、計画通りに進展していると思われる。
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| Strategy for Future Research Activity |
（１）私達の解析により、意外なことにPIG-Bは核内の染色体領域のゾーン形成にも関与する可能性が示唆されたため、今後はその可能性を検証する。また、TACの局在化因子は同定できたが、意外なタンパク質であったため、その局在化メカニズムがよくわからない。そこで、局在化メカニズムについても解析を進める。
（２）RNAiによりリン酸修飾ゾーンが減少したフォスファターゼのショウジョウバエ変異体を作出し、変異体でのFjの細胞内局在を調べる。さらにこのフォスファターゼの細胞内局在を明らかにする。リン酸修飾ゾーンが形成される培養細胞株で高発現している遺伝子のRNAiを翅成虫原基で行い、Fjの細胞内局在が変化する遺伝子を探索する。RNAiによりFjの細胞内局在が変化した遺伝子についてショウジョウバエ変異体を作出する。
（３）PTAR1が関わる選別輸送については、標的となるRab分子を同定することで、そのメカニズムを明らかにする。リビトールリン酸修飾分子や糖脂質の選別輸送障害、あるいは、それらを修飾する酵素が適切なゾーンに局在できないことに起因する修飾障害なのか、関連分子の細胞内局在を追跡することで明らかにする。更に、tempura変異体を用いた実験と比較することで、PTAR1介在の選別輸送の生物学的意義を明らかにする。また、リビトールリン酸修飾ゾーンについては、FKTN、FKRP、TMEM5の詳細なゴルジ体局在を検証し、ゾーンが形成されていることを実証する。
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