2020 Fiscal Year Annual Research Report
上皮細胞の極性輸送における細胞小器官内選別輸送ゾーンの有無とその意義
| Project Area | Toward an integrative understanding of functional zones in organelles |
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| Project/Area Number |
17H06422
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
原田 彰宏 大阪大学, 医学系研究科, 教授 (40251441)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
木下 タロウ 大阪大学, 微生物病研究所, 寄附研究部門教授 (10153165)
西野 美都子 大阪大学, 産業科学研究所, 准教授 (30510440)
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| Project Period (FY) |
2017-06-30 – 2022-03-31
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| Keywords | ゴルジ体 / GPI修飾酵素 / 糖転移酵素 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
１．GPI修飾酵素や糖転移酵素の局在する小胞体やゴルジ体の選別輸送ゾーンの視覚化
GPI修飾酵素遺伝子や糖転移酵素に、CRISPRを用いた遺伝子ノックイン法で様々なtagを挿入する。具体的には以下の実験を行った。
(1)GPI修飾酵素遺伝子や糖転移酵素にCRISPR法を用いたtagのノックインを行う。tagについては、9xc-myc, 3xV5などを用いたほか、ライブイメージングに使用できるよう、7xGFP11やSNAP-tag, CLIP-tag, Halo-tagを用いた。今年度固定サンプルについてproteoglycan合成酵素（NDST1, XYLT2など）、o-glycosylation酵素（GALNT）、N-glycosylation酵素（GnT1等）遺伝子へのノックインを行い、ノックインしたtagの染色に成功した。(2)tagをノックインした上皮細胞を固定後、tagに対する抗体を用いて蛍光免疫染色や免疫電顕用の染色後、超解像顕微鏡（計画班員の中野の有するSCLIMなど）や電子顕微鏡（トモグラフィー含む）を用いて選別輸送ゾーンの観察を行い、これらの酵素が異なるゾーンに局在することを可視化することに成功した。
２．GPIタンパク質、糖タンパク質とその修飾酵素の局在する選別輸送ゾーンとの関連
Rush systemを用いて作製した、GPIタンパク質や糖タンパク質のモデルタンパク質をCaco2細胞などに発現させて、それらのタンパク質が修飾される選別輸送ゾーン特異的に通過するか否かを検証し、固定サンプルでこれらが上記の異なるゾーンを通過することを確認出来た。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
(1)ノックインしたtagの染色は、その発現レベルによって可否が大きく左右される。我々はいくつかの遺伝子について発現量とその染色の有無を比較し、可視化できる発現レベルの閾値を概ね把握することが出来た。その結果、本年度、固定サンプルについてproteoglycan合成酵素（NDST1, XYLT2など）、o-glycosylation酵素（GALNT）、N-glycosylation酵素（GnT1等）遺伝子へのノックインを行い、ノックインしたtagの染色に無事成功したため。
(2)tagをノックインした上皮細胞を固定後、tagに対する抗体を用いて蛍光免疫染色や免疫電顕用の染色後、超解像顕微鏡や電子顕微鏡を用いて選別輸送ゾーンの観察を行い、これらの酵素が異なるゾーンに局在することを可視化することに成功したため。
２．GPIタンパク質、糖タンパク質とその修飾酵素の局在する選別輸送ゾーンとの関連
Rush systemを用いて作製した、GPIタンパク質や糖タンパク質のモデルタンパク質をCaco2細胞などに発現させて、それらのタンパク質が修飾される選別輸送ゾーン特異的に通過するか否かを検証し、固定サンプルでこれらが上記の異なるゾーンを通過することを確認出来たため。
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| Strategy for Future Research Activity |
１．GPI修飾酵素や糖転移酵素の局在する小胞体やゴルジ体の選別輸送ゾーンの視覚化
GPI修飾酵素遺伝子や糖転移酵素に、CRISPRを用いた遺伝子ノックイン法で様々なtagを挿入する。具体的には以下の実験を行った。
(1)さらに追加して、GPI修飾酵素遺伝子や糖転移酵素にCRISPR法を用いたtagのノックインを行う。具体的には、ライブイメージング用のtagをスクリーニングする、既に固定サンプルの染色に成功したtagについては、複数の種類のtagを用いて複数の糖転移酵素などの2重、3重染色を行い、それらの相対的な位置関係を調べる。
(2)tagをノックインした上皮細胞を固定後、tagに対する抗体を用いて蛍光免疫染色や免疫電顕用の染色後、超解像顕微鏡や電子顕微鏡を用いてこれらの酵素が異なるゾーンに局在することを可視化する。また１でライブイメージング用のtagのノックインに成功した場合、ライブイメージングを行って、これらの酵素の動きを調べる。
２．GPIタンパク質、糖タンパク質とその修飾酵素の局在する選別輸送ゾーンとの関連
Rush systemを用いて作製した、GPIタンパク質や糖タンパク質のモデルタンパク質をCaco2細胞などに発現させて、それらのタンパク質が修飾される選別輸送ゾーン特異的に通過するか否かを検証し、生細胞でこれらが上記の異なるゾーンを通過することを確認する。
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[Journal Article] SNAP23 deficiency causes severe brain dysplasia through the loss of radial glial cell polarity2021
Author(s)
M Kunii, Y Noguchi, S Yoshimura, S Kanda, T Iwano, Erda Avriyanti, Nur Atik, T Sato, K Sato, M Ogawa, A Harada
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Journal Title
J Cell Biol
Volume: 220
Pages: e201910080
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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[Journal Article] A post glycosylphosphatidylinositol (GPI) attachment to proteins, type 2 (PGAP2) variant identified in Mabry syndrome index cases: molecular genetics of the prototypical inherited GPI disorder.2020
Author(s)
Thompson, M., A. Knaus, A. Caliebe, H. Muhle, M. Nguyen, N. Baratang, T. Kinoshita, M. Percy, P. Campeau, Y. Murakami, P. Krawitz, D. Cole, and C. Mabry.
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Journal Title
Eur. J. Med. Genet
Volume: 63
Pages: 103822
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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