2017 Fiscal Year Annual Research Report
| Project Area | Principles of pluripotent stem cells underlying plant vitality |
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| Project/Area Number |
17H06474
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
山口 信次郎 東北大学, 生命科学研究科, 教授 (10332298)
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| Project Period (FY) |
2017-06-30 – 2022-03-31
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| Keywords | 植物幹細胞 / シグナル分子 / 植物 / シロイヌナズナ / イネ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
イネのplastochron1 (pla1）変異体やシロイヌナズナのkluh（klu）変異体は、一定期間に着ける葉の数が多い突然変異体であり、腋芽幹細胞を生成するタイミングが野生型と比較して速くなっている。これまでの研究から、PLA1/KLU遺伝子は機能未知のシトクロムP450酸化酵素（CYP78A）をコードすることが明らかにされているが、この酵素の植物体内での基質や生成物は解明されていない。
CYP78Aの組換え酵素を用いた以前の研究から、同酵素が試験管内で脂肪酸の一種であるラウリン酸の水酸化を触媒することが報告されている。一方で、水酸化ラウリン酸を投与してもklu変異体の表現型は相補されないことから、水酸化ラウリン酸は植物体内における真のCYP78A生成物ではないとも考えられている。本年度はこの点を追究するため、ヒメツリガネゴケのcyp78a変異体における水酸化ラウリン酸の内生量を野生型と比較した。まず、重水素標識した水酸化ラウリン酸を調製し、これを内部標準物質として液体クロマトグラフ-タンデム型質量分析装置により定量分析を行った。その結果、水酸化ラウリン酸の内生量はcyp78a変異体において減少していなかった。以上の結果から、水酸化ラウリン酸は植物体内におけるCYP78Aの生成物ではないと考えられる。
本年度は、CYP78Aの基質と生成物の同定を目指し、CYP78Aシグナルの下流遺伝子を同定するためのトランスクリプトーム解析の準備を行った。また、cyp78a変異体で野生型と比較して蓄積または減少している代謝産物を同定するための実験材料の調製を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は水酸化ラウリン酸の定量分析法を確立し、ヒメツリガネゴケのcyp78a変異体においては水酸化ラウリン酸の内生量が低下していないことを明らかにした。したがって、今後、CYP78Aの植物体内における真の基質と生成物を同定する必要がある。
CYP78Aの真の基質と生成物を明らかにするため、CYP78Aシグナルに応答する遺伝子群を同定し、これらの遺伝子の発現を指標にCYP78Aシグナルの検出と精製を試みる。本年度は、イネのCYP78AであるPLA1が発現する組織である茎頂部を用いたトランスクリプトーム解析の準備を行った。
CYP78Aの基質と生成物を同定するためのもう一つのアプローチとして、質量分析計を用いて代謝産物の網羅的な解析を行い、cyp78a変異体と野生型植物における代謝産物の差異の検出を試みる。この方法の欠点は、二次的な影響を受ける代謝産物（変異体の表現型の原因ではなく結果として変化するもの）も候補として検出されてしまう可能性が高いことである。そこで本年度は、誘導型プロモーターの制御下でCYP78Aを発現する形質転換体を作出した。同形質転換植物を用いることにより、CYP78Aの発現誘導後、短時間で変化する代謝産物の同定が可能になることが期待される。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、イネのpla1変異体およびシロイヌナズナのklu変異体における水酸化ラウリン酸の定量分析を行う。また、イネのCYP78AであるPLA1が発現する組織である茎頂部をレーザーマイクロダイセクション法により集め、トランスクリプトーム解析を行うことにより、CYP78Aシグナルの下流の遺伝子群を同定する。CYP78A応答遺伝子群の特徴を明らかにするとともに、これらの遺伝子をマーカーとして利用し、CYP78Aシグナルの同定を試みる。さらに、誘導性プロモーターの制御下でKLU/CYP78Aを発現する形質転換シロイヌナズナを用いて、CYP78A遺伝子の発現誘導後、短時間で増加または減少する代謝産物の同定を試みる。
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