2019 Fiscal Year Annual Research Report
| Project Area | Principles of pluripotent stem cells underlying plant vitality |
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| Project/Area Number |
17H06474
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
山口 信次郎 京都大学, 化学研究所, 教授 (10332298)
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| Project Period (FY) |
2017-06-30 – 2022-03-31
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| Keywords | 植物幹細胞 / シグナル分子 / 植物 / シロイヌナズナ / イネ / ヒメツリガネゴケ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
イネのplastochron1 (pla1)変異体やシロイヌナズナのkluh(klu)変異体は、一定期間に着ける葉の数が多い突然変異体であり、腋芽幹細胞を生成するタイミングが野生型と比較して速くなっている。これまでの研究から、PLA1/KLU遺伝子は機能未知のシトクロムP450酸化酵素(CYP78A)をコードすることが明らかにされている。本研究では、CYP78Aの植物体内での基質および生成物の同定を目指し、CYP78A由来の低分子シグナル（CYP78Aシグナル）が腋芽幹細胞の新生のタイミングをどのように調節しているのかを明らかにしたいと考えている。本年度は以下の実験を行った。
(1) 前年度までに、PLA1遺伝子が発現しているイネの茎頂部を単離し、トランスクリプトーム解析を行うことにより、PLA1応答遺伝子群を同定した。本年度は、これらのデータを詳細に解析するとともに、シロイヌナズナのklu変異体の茎頂部を用いたトランスクリプトーム解析を行った。現在、CYP78Aシグナルに対する応答を検出するためのマーカー遺伝子の選抜を試みている。マーカー遺伝子が得られた場合は、CYP78A遺伝子を発現する植物組織の抽出画分から、マーカー遺伝子の発現を誘導（または抑制）できる化合物を探索する。
(2) ヒメツリガネゴケのCYP78A27とCYP78A28の二重破壊株（cyp78a二重変異体）は、コロニーサイズが顕著に低下し、茎葉体の形成が不全となる。本年度は、CYP78Aシグナル探索のためのアッセイ系の確立を目指し、cyp78a二重変異体の表現型のより詳細な解析を行った。
(3)カロテノイドに由来する植物ホルモンであるストリゴラクトンは、腋芽幹細胞の活性調節に働いていると推定される。本年度は、ストリゴラクトンの生合成および受容機構に関する研究を前年度に引き続き行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
前年度までにpla1変異体と野生型の茎頂部の比較トランスクリプトーム解析を行い、本年度は詳細なデータ解析を行った。その結果、サイトカイニンの生合成酵素および不活性化酵素をコードする遺伝子の挙動から、サイトカイニンの一種であるトランスゼアチンがpla1変異体で増加していることをサポートする結果が得られた。CYP78Aシグナルを探索するために有効なマーカー遺伝子を探索する目的で、シロイヌナズナのklu変異体と野生型の茎頂部を用いたRNAシーケンス解析を行った。現在、データの解析を行っている。これらの比較トランスクリプトーム解析から、CYP78Aシグナルの探索に有効なマーカー遺伝子を見出したいと考えている。
ヒメツリガネゴケのcyp78a二重変異体は、コロニーサイズが顕著に低下し、茎葉体の形成が不全となる。CYP78A酵素の生成物を同定するため、CYP78A28過剰発現体の抽出物を分画し、cyp78a二重変異体に投与したところ、ある画分を投与した場合に原糸体の伸長が観察された。コントロールとして同じ抽出画分をcyp78a二重変異体から調製し、cyp78a二重変異体に投与した場合には、原糸体の伸長は認められなかった。現在、このアッセイ系の再現性を検討している。
本年度はさらにヒメツリガネゴケのcyp78a二重変異体およびCYP78A過剰発現体の表現型をより詳細に解析した。その結果、cyp78a二重変異体においては原糸体の枝分かれが減少し、CYP78A過剰発現体では原糸体の枝分かれが増加することが明らかになった。今後は、この表現型がCYP78Aシグナル探索の指標として利用可能であるかを検討する予定である。
ストリゴラクトンに関しては、新規生合成酵素の機能解析を進めるとともに、生合成制御に関する新たな知見を得た。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでにイネの茎頂部におけるPLA1応答性遺伝子群を得ることができた。また、シロイヌナズナの茎頂部におけるKLU応答性遺伝子群を得るためのデータ解析が進行中である。これらの結果から、CYP78Aシグナル応答のマーカー遺伝子を見出し、植物組織の抽出画分から、マーカー遺伝子の発現量を変化させる化合物の探索を進めて行く予定である。
ヒメツリガネゴケのcyp78a二重変異体およびCYP78A過剰発現体の原糸体の枝分かれの表現型に関しては、今後、この表現型を指標としたCYP78Aシグナルの探索に利用できるのかどうか（植物抽出画分で表現型が相補されるのかどうか等）を調べて行く予定である。今後、領域全体で「オーキシンシグナルの低下が幹細胞の維持（新生）に重要である」という作業仮説を検討する予定である。原糸体の枝分かれは幹細胞の新生を伴うこと、オーキシンによって負に調節されることが知られている。したがって、本作業仮説の検討の一環として、cyp78a二重変異体およびCYP78A過剰発現体の枝分かれの表現型とオーキシンとの関連性を調べる予定である。
ストリゴラクトンについては、新規生合成酵素の機能を生化学的、遺伝学的手法によって解析する。これらの解析により、腋芽伸長を制御するホルモンとしてのストリゴラクトンの活性本体を明らかにする。
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