2020 Fiscal Year Annual Research Report

幹細胞新生のタイミングを制御する分子機構の解明

Planned Research

Project Area	Principles of pluripotent stem cells underlying plant vitality
Project/Area Number	17H06474
Research Institution	Kyoto University
Principal Investigator	山口信次郎京都大学, 化学研究所, 教授 (10332298)
Project Period (FY)	2017-06-30 – 2022-03-31
Keywords	植物幹細胞 / シグナル分子 / 植物 / シロイヌナズナ / イネ / ヒメツリガネゴケ
Outline of Annual Research Achievements	シロイヌナズナのkluh (klu)変異体やイネのplastochron1 (pla1)変異体は、一定期間に着ける葉の数が多い突然変異体であり、腋芽幹細胞を生成するタイミングが野生型と比較して速くなっている。これまでの研究から、PLA1/KLU遺伝子は機能未知のシトクロムP450酸化酵素（CYP78A）をコードすることが明らかにされている。本研究では、CYP78Aの植物体内での基質と生成物の同定を目指し、CYP78A由来の低分子シグナル（CYP78シグナル）が腋芽幹細胞の新生のタイミングをどのように調節しているのかを明らかにしたいと考えている。本年度は以下の実験を行った。 (1) 前年度までにイネとシロイヌナズナの茎頂部を材料に行ったトランスクリプトーム解析の結果から、CYP78シグナルによって制御されるマーカー遺伝子を選抜した。ヒメツリガネゴケのCYP78過剰発現体から得られた抽出物を分画し、各画分をシロイヌナズナのcyp78a二重変異体の茎頂部に与えたところ、マーカー遺伝子の発現を有意に増加させる画分が見出された。現在、この結果の再現性を確認している。 (2) ヒメツリガネゴケのcyp78a二重変異体は側枝の枝分かれが抑制され、CYP78A過剰発現体では枝分かれが増加することを明らかにした。側枝の枝分かれはオーキシンにより抑制されることが知られている。cyp78a二重変異体では原糸体におけるオーキシン（インドール酢酸）の内生量が増加し、逆に培地に放出されるオーキシン量はCYP78A過剰発現体で増加することが明らかになった。これらの結果から、CYP78シグナルはオーキシンの分布に影響を与えることが示された。 (3) 腋芽幹細胞の活性調節に働いているストリゴラクトンの修飾酵素の機能を新たに同定した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 本年度は、以前に行ったイネとシロイヌナズナの茎頂部におけるトランスクリプトーム解析からCYP78シグナルのマーカー遺伝子を選抜した。これらの遺伝子発現を指標にヒメツリガネゴケCYP78A過剰発現体の抽出物中に、マーカー遺伝子の発現を有意に上昇させる画分を得ることができた。コントロールとして同じ画分をcyp78a二重変異体から調製した場合には、マーカー遺伝子の発現の有意な上昇は認められなかった。現在、これらの結果の再現性を確認している。当研究領域全体で「オーキシンシグナルの低下が幹細胞の維持（新生）に重要である」という作業仮説の検証を行っている。本年度は、ヒメツリガネ原糸体において幹細胞新生を伴う側枝の形成をCYP78シグナルがオーキシン内生量の増加を介してネガティブに制御している可能性を支持する結果を得た。この結果は、領域全体の作業仮説をサポートするものである。また、本年度は腋芽幹細胞の活性調節に関わる植物ホルモンであるストリゴラクトンの研究においても新たな知見を得ることができた。
Strategy for Future Research Activity	今年度は、マーカー遺伝子の発現量を指標にしたヒメツリガネゴケの抽出画分におけるCYP78シグナル活性の検出と精製を引き続き行う。活性画分の更なる精製を進め、CYP78シグナルの単離を目指す。「オーキシンシグナルの低下が幹細胞の維持（新生）に重要である」という作業仮説の検証に関しては、ヒメツリガネゴケ原糸体の側枝形成において、CYP78シグナルがどのようにオーキシンの分布を変化させるのかを明らかにする。ヒメツリガネゴケのcyp78a二重変異体は、茎葉体の形成が不全であり、茎葉体ではなく細胞塊が形成される。この際、サイトカイニンの関与が示唆されることから、CYP78シグナルとサイトカイニンの関係を調べる。ストリゴラクトンに関しては、本年度に酵素機能を解明したイネの新たな修飾酵素の生理機能の解明を目指して、ゲノム編集により作出した当該酵素遺伝子の変異体と過剰発現体の詳細な解析を行う。