2019 Fiscal Year Annual Research Report
Molecular mechanisms underlying transiency and perpetuality of plant stem cells
| Project Area | Principles of pluripotent stem cells underlying plant vitality |
|---|
| Project/Area Number |
17H06476
|
|---|
| Research Institution | Nagoya University |
|---|
Principal Investigator |
鳥居 啓子 名古屋大学, トランスフォーマティブ生命分子研究所, 客員教授 (60506103)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
近藤 侑貴 東京大学, 大学院理学系研究科(理学部), 助教 (70733575)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2017-06-30 – 2022-03-31
|
| Keywords | 植物 / 気孔 / 維管束 / 一過的幹細胞 / 恒久的幹細胞 / 一細胞解析 / 非対称分裂 / 対称分裂 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、植物表皮の気孔をつくる一過的な幹細胞、および、植物の二次成長を担う維管束の恒久的な幹細胞に着目し、それら幹細胞の一細胞レベルでの観察と操作が可能な系を確立・駆使し、そのゲノム動態や分裂能を比較解析することにより、植物の多能性幹細胞の本質に迫ることを目的とする。
研究代表者（鳥居）は、気孔系譜の一過的幹細胞の維持と分化の制御に着目し研究を進めている。本年度は主に(1)非対称分裂(増殖分裂)から対称分裂(最終分化)への転換に関わる細胞周期のブレーキ因子の機能解析、(2)気孔系譜のオープンクロマチン領域の網羅的解析を介して、幹細胞の誕生および増殖時にオープンなクロマチン領域に共通の配列と、その配列に結合する一群の転写因子の同定と機能解析 (3)環境因子や内的生理による気孔系譜幹細胞性の制御、の３つのテーマを遂行した。
研究分担者（近藤）は、維管束幹細胞の維持と分化の制御機構に迫っている。本年度は、VISUAL分化誘導過程における葉組織片からプロトプラストを単離し、Nadiaを用いた1細胞分取をおこなった。支援班・蓑田班の協力のもと、NGSライブラリーを作成し、HiSeqにてシーケンス解析をおこなったが、得られた1細胞あたりのリード数はかなり低く、細胞種のクラスタリング解析にはいたらなかった。一方で幹細胞分化に重要な働きをもつ転写因子BES1の機能欠損変異体bes1に対する表現型抑圧スクリーニングからサプレッサー変異体を取得した。本年度はNGS解析から、原因遺伝子を2個同定した。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
気孔系譜の一過的幹細胞の維持と分化: (1)メリステモイド細胞の分化には細胞周期のスローダウンが重要な役割を果たすとの仮説を立てた。仮説に基づいた探索を行い、メリステモイド細胞分化時に特異的に誘導される細胞周期阻害遺伝子を発見した。この遺伝子を気孔系譜内で過剰発現すと、気孔と表皮細胞のハイブリッド様細胞が発生し、一方、欠損する突然変異体では、対称分裂の速度が非対称分裂と同様に速くなっていた。そのため、気孔系譜細胞の細胞周期の制御と分化は細胞周期のスローダウンによって協調されていることが示唆された。
(2)ATAC-seqから、一過的幹細胞時にクロマチンがオープンで分化とともにクロマチンが凝集する領域に特異的なDNA配列を同定した。Yeast 1 hybrid法により特異的配列に結合する転写因子を探索し、一連の転写因子ファミリーを同定した。この多重変異体では表皮に過剰な非対称分裂が起きた。この表現型はSPEECHLESS過剰発現と類似する。そのため、これら転写因子は気孔系譜の開始を抑制する因子であると考察した。
(3) 環境因子や内的生理による気孔系譜幹細胞性の制御: MUTEとSCREAMのヘテロ二量体形成を阻害することにより、気孔系譜の発生を停止させる因子を同定した。この因子は、ストレス要因によって発現誘導され、過剰発現させた植物では、メリステモイド細胞が発生を停止する。そのため、植物がストレス環境下に置かれた際、気孔の分化を迅速に停止させるブレーキ役であると考えられる。
維管束幹細胞の永続性を担う転写因子間の競合については、6重変異体の表現型などデータが出揃い現在論文投稿の準備を進めている。維管束幹細胞の1細胞解析については、単離からデータ解析までの一連の流れを予備的な実験で検討した。明らかとなった問題点を克服していくことで、引き続き幹細胞運命の分岐について解析を進めていく。
|
| Strategy for Future Research Activity |
気孔系譜の一過的幹細胞：(1) 非対称分裂(増殖分裂)から対称分裂(最終分化)への転換に関わる細胞周期のブレーキ因子の機能解析に関しては、現在、様々な高次突然変異体や様々な蛍光タンパク質マーカーを導入しており、この細胞周期阻害因子の発生学的機能を詰める予定である。さらに可能であれば、GFPマーカー発現を指標にハイブリッド様細胞における一細胞トランスクリプトームの解析を試みる。論文をまとめる。
(2) 気孔系譜のエピゲノム解析から一過性幹細胞の開始を制御する転写因子の同定：オープクロマチンの網羅的解析から同定した一連の転写因子が、直接SPCHの発現抑制に関わるかどうかを、ルシフェラーゼレポーター法およびChIP法により解析する。さらに転写因子ファミリーの高次突然変異体の作出および気孔系譜のレポーター系統と掛け合わせを行い、表現型解析を詰める。論文をまとめる。
(3) 環境因子や内的生理による気孔系譜幹細胞性の制御：ストレス誘導される新奇因子がMUTEとSCREAMのヘテロ二量体形成を阻害することによりMUTEの機能を阻害する、という仮説を、3-way BiFC、レポーターエフェクター法、ChIPアッセイなどの手法で追求する。新奇因子を強く誘導するストレスホルモンによる気孔発生抑制の分子機構に迫る。
維管束幹細胞性: Nadiaの流路を通過する際に細胞の破裂等がみられたことから、セルストレーナーを用いて細胞サイズを制限することできれいな1細胞を効率よく採取できると考えた。条件を最適化し、１細胞解析による運命分岐の擬時刻再構成を目指す。また同定した幹細胞分化に関わる新規遺伝子に関して解析を進め、幹細胞分化を制御する分子機構にせまっていく。加えて、領域で課題としているオーキシンと幹細胞新生についての研究も発光顕微鏡イメージングを駆使して取り組んでいく予定である。
|
