2019 Fiscal Year Annual Research Report
Development of optical probes and actuators to investigate singularity cells
| Project Area | Singularity biology |
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| Project/Area Number |
18H05410
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
永井 健治 大阪大学, 産業科学研究所, 教授 (20311350)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
吉村 英哲 東京大学, 大学院理学系研究科(理学部), 助教 (90464205)
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| Project Period (FY) |
2018-06-29 – 2023-03-31
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| Keywords | イメージング / 蛍光 / 発光 / 生理機能操作 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は領域発足時より進めている、各種可視化プローブおよび細胞操作ツールの開発を引き続き行い、実際に生きた細胞に導入してその性能を評価した。以下の1、２，３の課題を設定してそれぞれ開発を進めた。
1.化学発光および光音響を利用したリアルタイム機能イメージング法の開発: 組織や個体内の１細胞機能を捉えるための、化学発光および光音響効果を利用した細胞機能プローブの開発を行った。また、励起エネルギー移動によりルシフェラーゼ発光を赤色・近赤色化するため様々な蛍光タンパク質との組み合わせの効果を検証した。
2.時空間トランススケール生体操作ツール群の創出とシンギュラリティ現象の操作法開発: 技術的優位性が確立されている青色光受容体を用いたオプトジェネティクスツールの開発を中心に行った。具体的には植物光受容体LOV2-Jαを用いてRNA結合タンパク質ドメインPUM-HDの機能を制御する光応答型内在性RNA捕捉ツールを開発した。また、細胞間張力の制御を指向した光応答型カドヘリン分子の開発を行った。
3. 領域内での連携による各開発: A03生物班や公募班の要望に応じて可視化プローブおよびオプトジェネティクスツールの開発を進め、段階的に成果を得た。また技術開発支援班の有する装置を利用して、新規な分析方法の可能性を模索した。最終的にAMATERASを用いて解析をすることを想定して、領域として有する知見や技術を活かした有機的な連携を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
1. 化学発光による生体プローブ開発を複数の標的に対して並行して進めた。そのうち、化学発光と蛍光双方で検出が可能なバイモーダルCa2+プローブについて実際に細胞に導入することで、薬剤刺激に対するCa2+の増減をリアルタイムに検出することに成功した。開発の成果を投稿論文にて発表した。
赤色あるいは近赤外色の高光度化学発光タンパク質の開発を目標として、既存の発光タンパク質に蛍光タンパク質を連結することで、FRET現象による長波長側への波長シフトを試みた。使用する蛍光タンパク質種や連結の順番を複数試すことにより、その効果を検証した。
2. 光応答型RNA機能操作ユニットの開発に着手した。具体的にはRNA結合タンパク質ドメインPUM-HDの二分割体候補分子ライブラリを構築した。またGolden Gate法を用いて変異PUM-HDモチーフのライブラリを構築し、多様な標的RNA配列に対応する準備を整えた。加えて、光応答型カドヘリンを構築し、細胞間張力を光照射により制御する系を開発した。開発の成果を投稿論文にて発表した。
3. A03-1班との連携としてタウ凝集を検出する化学発光プローブおよび光操作ツールの開発を行った。化学発光プローブでは、細胞中でタウタンパク質の凝集を特異的に検出するプローブを開発し、凝集を誘導する薬剤を細胞添加した際の発光上昇を確認した。光操作ツールでは、青色光受容体とタウタンパク質を組み合わせて、培養細胞中のタウタンパク質を光照射により凝集できるツールを構築した。
技術開発支援班が開発したセルソーターを利用して、化学発光を呈する細胞もしくはタンパク質単離の可能性を検討した。計画班が有する高輝度発光タンパク質に対して、その発光が検出できることを確認した。
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| Strategy for Future Research Activity |
化学発光タンパク質eNLの高輝度化および細胞機能プローブへの応用: eNLの構成成分のうち蛍光タンパク質を他の種類に置き換えることで高輝度化を行う。各種細胞機能プローブへ導入し、トランススケールイメージングへの適用を進める。
耐酸性蛍光タンパク質の多色化: 緑色蛍光タンパク質Gamillusが有する耐酸性を保持したまま、現在の緑色から短波長もしくは長波長へシフトした変異体を開発する。開発した変異体タンパク質を使用することで、細胞中の様々な環境下で可視化解析が可能な、生理機能プローブを開発する。
生体適応性を示す外部刺激応答ユニットの開発: ダウンコンバージョンやアップコンバージョンを示すナノ粒子やルシフェラーゼを用いた生体内部で発生する青色光を用いた操作系、ferritin変異体内で自発的に形成する磁性ナノ粒子を用いた操作系など、各種マテリアルを利用することで、生体深部での機能発現を指向した生体変換ユニット群を開発する。
各種生理現象の光制御・操作を実現する分子ユニットの開発：二分割型PUM-HDと植物光受容体LOV2-Jαを融合して、RNA結合タンパク質ドメインPUM-HDの機能を制御する光応答型内在性RNA捕捉ツールを開発する。またA03-2班と連携し、光刺激によりゲノム編集のON/OFFを精密に制御する方法を開発し、初期発生や分化における生理プロセスの光操作法開発を行う。
タウタンパク質凝集を検出する化学発光プローブおよび光操作ツールの開発: 開発した赤色化学発光プローブについて、その性能をマウス神経芽細胞を用いて評価する。高輝度化学発光タンパク質によるプローブも並行して開発し、マウス脳に導入した際に効果的に発光が検出できるプローブを最終的に選択する。光操作ツールについては、光刺激による凝集が当該細胞内および周囲の細胞に伝播するかどうか、マウス神経芽細胞を用いて検証する。
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