2019 Fiscal Year Annual Research Report
Single cell manipulation and gene expression analysis for "Singularity Biology"
| Project Area | Singularity biology |
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| Project/Area Number |
18H05411
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
城口 克之 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, チームリーダー (00454059)
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| Project Period (FY) |
2018-06-29 – 2023-03-31
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| Keywords | １細胞解析 / 網羅的遺伝子発現解析 / 細胞操作 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
“シンギュラリティ生物学”の創生に向けて、本研究では、シンギュラリティ細胞やシンギュラリティ現象が起きる際の細胞の内部状態（遺伝子発現）はどうなっているのか？ シンギュラリティ細胞が出現する時の最初の変化は何なのか？ という問いに答えるための研究を行っている。具体的には、イメージングで特定した細胞を分取して網羅的遺伝子発現解析を行うシステムを開発し、領域内で開発する広視野顕微鏡に実装する。これにより、新学術領域内外の研究者が対象としているシンギュラリティ現象を解析して、シンギュラリティ細胞の分子マーカーを決定するとともに、シンギュラリティ現象をもたらすメカニズムを分子（遺伝子）レベルで理解することを目的としている。
本年度は、顕微鏡下で分取した１つの細胞がウェル内に確実に吐き出されたかを確認するために、ニードルの先と細胞がウェル内の溶液に位置した時の様子を観察・記録できるシステムを開発した。この際、通常のウェルでは吐き出される細胞を確認することが困難だったため、市販のウェルに工夫を加えることで、再現良く細胞を確認できるようになった。細胞の分取においては、顕微鏡のソフトウェアを用いた細胞の位置計測、細胞分取装置への情報送信、分取装置での分取と吐出し、といったそれぞれの要素を自動化することができた。シークエンシング用のサンプル準備において、独自に開発してきたcDNAを作製する工程を自動分注機にプログラムし、96個の単一細胞（１プレート）からcDNAライブラリを一度に合成するシステムを構築した。また、３次元サンプルにおいて、効率よく切片化する条件を検討した。さらに、広域観察が可能な顕微鏡に、本細胞分取装置を設置した。情報通信などのセッティングはこれからとなる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
顕微鏡下で観察後に分取した１つの細胞がウェル内に確実に吐き出されたかを確認するために、ニードルの先と細胞がウェル内の溶液に位置した時の様子を観察・記録できるカメラシステムを開発した。この際、通常のウェルでは吐き出される細胞を確認することが困難だったため、市販のウェルに工夫を加えることで、再現良く細胞を確認できるようになった。細胞の分取においては、顕微鏡のソフトウェアを用いた細胞の位置計測、細胞分取装置への情報送信、分取装置での分取と吐出し、といったそれぞれの要素を自動化することができた。シークエンシング用のサンプル準備において、独自に開発してきたcDNAを作製する工程を自動分注機にプログラムし、96個の単一細胞（１プレート）からcDNAライブラリを一度に合成するシステムを構築した。DNA分子バーコード法を用いたcDNAライブラリ合成によるシークエンス結果から、細胞内のmRNAの分子数を計数する解析パイプラインの基盤部分を完成させた。また、３次元サンプルにおいて、効率よく切片化する条件を検討した。さらに、広域観察が可能な顕微鏡に、本細胞分取装置を設置、分取装置の動作を確認した。顕微鏡ステージと分取装置間など、情報通信のセッティングはこれからとなる。
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| Strategy for Future Research Activity |
顕微鏡イメージングで同定した細胞を分取し、その遺伝子発現を解析するシステムの自動化作業を高度化するため、さらに細胞を分取する装置の開発を改良していく。具体的には、自動化できた要素を組み合わせて、全体を自動化する。その後、９６プレートを用いて、９６個の細胞の連続自動分取を実施し、その性能（時間や正確性など）を評価し、さらなる改良を検討する。また、どれくらいの大きさのサンプルまで分取できるのかなどの性能も評価する。シークエンス解析においては、シークエンスの結果から遺伝子発現量を解析するパイプラインを完成させる。より多くの細胞の解析に対応するため、高速化などに対応する。改良されていくAMATERASに対応して、分取の設置の仕方も検討していく。AMATERASによる観察から得られた細胞の位置情報などを分取の装置に送信できるように同期を行い、AMATERASを用いた分取の自動化の試みを開始する。領域内外での連携として、開発してきた分取装置を用い、領域で対象としているサンプルの分取を開始する。対象に合わせた分取装置のチューニングを行う。
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[Journal Article] HaloTag-based conjugation of proteins to barcoding-oligonucleotides2020
Author(s)
3.Yazaki J*, Kawashima Y, Ogawa T, Kobayashi A, Okoshi M, Watanabe T, Yoshida S, Kii I, Egami S, Amagai M, Hosoya T, Shiroguchi K, Ohara O
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Journal Title
Nucleic Acids Res
Volume: 48
Pages: e8
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Osteoprotegerin-dependent M cell self-regulation balances gut infection and immunity2020
Author(s)
2.Kimura S*, Nakamura Y, Kobayashi N, Shiroguchi K, Kawakami E, Mutoh M, Takahashi-Iwanaga H, Yamada T, Hisamoto M, Nakamura M, Udagawa N, Sato S, Kaisho T, Iwanaga T, Hase K
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Journal Title
Nat Commun.
Volume: 11
Pages: 234
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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