2019 Fiscal Year Annual Research Report
生体発動分子の創成：自然界の生体分子の改造とゼロからの設計
| Project Area | Molecular Engine: Design of Autonomous Functions through Energy Conversion |
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| Project/Area Number |
18H05420
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| Research Institution | National Institute of Information and Communications Technology |
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Principal Investigator |
古田 健也 国立研究開発法人情報通信研究機構, 未来ICT研究所フロンティア創造総合研究室, 主任研究員 (40571831)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
古賀 信康 大学共同利用機関法人自然科学研究機構(新分野創成センター、アストロバイオロジーセンター、生命創成探究, 生命創成探究センター, 准教授 (50432571)
小杉 貴洋 分子科学研究所, 協奏分子システム研究センター, 助教 (00771388)
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| Project Period (FY) |
2018-06-29 – 2023-03-31
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| Keywords | 生物分子モーター / DNAナノテクノロジー / タンパク質デザイン / ATP加水分解酵素 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
新規リニア型分子モーターの開発に関して、複数の異なる輸送を一本のDNAナノチューブ上で実現するために、本年度は、認識配列が異なる２種類以上のモーターのスクリーニングを行い、7種類以上のモーターの開発に成功した。
ATPに結合する生体発動分子の設計に関しては、昨年度に引き続きATPのリン酸基に結合する特徴的なモチーフ構造であるP-loopモチーフを含んだ安定なタンパク質の設計を試みた。昨年度設計したタンパク質の多くは安定な構造を持っていたが、その中にATP結合活性を示すものはなかった。今年度は昨年度の設計タンパク質に対する計算・実験結果から、改善点を見つけ出し、設計タンパク質の改良を行なった。
複合体形成能を有する生体発動分子の設計に関しては、これまでに設計に成功している全てαヘリックスからなる人工タンパク質を、そのタンパク質の表面が持つ凹凸による表面間の噛み合わせを利用した相互作用面をデザインすることで、６量体化することを目指した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
上記のように、認識配列が異なる２種類以上のモーターが１本のDNAナノチューブ上に実際に共存可能であることが示された。これにより、複数の異なる分子を別々の場所に輸送することにより、分子の濃縮などの仕事が可能になる。
ATPに結合する生体分子の設計に関して、昨年度設計したATP結合タンパク質は、部分的に構造が崩れているため、検出できないほどATP結合活性が低かったのではないかと考えた。そこで、今年度は、昨年度の設計タンパク質に対する計算・実験結果から安定性が不十分であると予想される部分を主鎖構造から作り直した。これにより、より安定なATP結合部位を持つと考えられるタンパク質を設計することができた。そこで、これらの設計タンパク質を、大腸菌を用いて発現・精製した。そして、これらのタンパク質が設計通りに二次構造を持ち、単量体かつ安定な三次元構造を形成していることが確認できたため、蛍光偏光法によりATP結合活性を測定すると、それらのタンパク質のうちの一つから僅かなATP結合活性が検出された。この設計タンパク質のP-loopの中の保存されたアミノ酸を変異させた際にはその結合活性が大幅に下がったため、ATPはP-loop周辺に結合していると考えられる。
複合体形成能を有するタンパク質に関しては、二次構造が全てαヘリックスからなる設計タンパク質をC６対称に配置し、それぞれを対称かつランダムに並進および回転させる事で複合体主鎖配置を多数生成した後に、界面の炭素-炭素接触数が多く、接触表面積が大きいものを選抜した。そして、選抜された高い形状相補性を有する対称多量体構造について、多量体界面にあるアミノ酸残基を２０残基程度改変し、６量体を形成するようなタンパク質を計算機で複数デザインした。
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| Strategy for Future Research Activity |
新規リニア型分子モーターの開発に関しては、現状ではガラス面に固定したモーター上をDNAナノチューブがスライディングする方法で運動を引き起こしているが、今後、複数のモーターを一つに荷物に結合させたり、DNAナノチューブの構造の最適化などを行うことにより、DNAナノチューブ上での荷物の輸送を目指す。
ATP結合タンパク質に関しては、今年度設計した弱くATPに結合していると考えられるタンパク質に対して、より正確なATP結合活性を測定するために、蛍光偏光法以外のより低活性の結合能を精度良く測定できる方法により検証することを目指す。また、ATP結合活性がみられた設計タンパク質の結晶構造解析を行うことにより、設計タンパク質が設計通りの構造をしているか、設計通りにATPを結合しているかなどを検証していきたい。さらにATP加水分解活性を持つことも予想されるので、ATP加水分解活性の測定も行っていく予定である。
複合体形成能を持つタンパク質に関しては、設計したタンパク質を実際に大腸菌を用いて発現・精製し、SEC-MALSを用いて複合体形成能を検証する予定である。
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Research Products
(24 results)
