2019 Fiscal Year Annual Research Report
Biophysical analysis of the cell wall-plasma membrane interface using GFP-based tension and calcium sensors
| Project Area | Elucidation of the strategies of mechanical optimization in plants toward the establishment of the bases for sustainable structure system |
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| Project/Area Number |
18H05491
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| Research Institution | Saitama University |
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Principal Investigator |
豊田 正嗣 埼玉大学, 研究機構, 准教授 (90714402)
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| Project Period (FY) |
2018-06-29 – 2023-03-31
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| Keywords | 植物 / バイオセンサー / 機械刺激 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
植物は外力（力学的刺激）を受容して、自立的かつダイナミックに生体構造を変化させる（力学的最適化戦略）。この力学的最適化戦略は、持続可能な（サステナブル）社会・資源・建築を実現するために重要な能力であるが、その根幹を成す植物の力学的刺激受容機構は明らかになっていない。本研究では、外力によって発生する張力およびカルシウムシグナルを可視化するイメージング技術を開発し、植物の力学的刺激受容・フィードバック機構を解明する。さらに、これらの新しい技術を用いて、生きた植物の構造力学的パラメーターを取得し、力学的最適化を可能にする植物の原理を抽出することで、次世代のサステナブル建築構造モデルを構築する。
今年度は、フェムト秒パルスレーザーを用いた植物細胞におけるマイクロメートルオーダーの力学的刺激を感受するメカニズムの研究、生体内に発生する張力に応答して蛍光強度が変化する張力センサーの開発、広視野・ポータブルカメラ・蛍光イメージングシステムの開発などを行った。フェムト秒パルスレーザーを用いて、根の皮層細胞にマイクロメートルレベルの損傷を与えたところ、即座に細胞外のグルタミン酸レベルおよび細胞内のカルシウム濃度が上昇し、これらのシグナルが隣接する数細胞に伝搬することが明らかになった。すなわち、組織・細胞レベルで観察されていた全身性の傷害応答を細胞レベルで解析することに成功した。GFP型張力センサーは、リンカーなどの最適化を行いながら、in vitroスクリーニングを行った。50 cm程度の大きな試料を、任意の角度から蛍光イメージングができる広視野・ポータブルカメラ・蛍光イメージングシステムは概ね完成し、パイロット実験を開始した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
植物細胞におけるマイクロメートルオーダーの力学的刺激（微小な傷害刺激）を感受するメカニズムを理解するために、レーザーアブレーション技術を組み込んだ共焦点レーザー蛍光顕微鏡システムを使用した。フェムト秒パルスレーザーを用いて、根の皮層細胞に局所的なマイクロメートルレベルの損傷を与えたところ、即座に(1)細胞外（アポプラスト）のグルタミン酸レベルおよび（２）細胞内のカルシウム濃度が上昇し、これらのシグナルが隣接する数細胞に伝搬することがわかった。グルタミン酸およびカルシウムの拡散係数を解析したところ、これらのシグナルは単純拡散ではなく、能動的な伝搬（輸送）成分が含まれていることが示唆された。根の植物細胞は、微小な細胞膜の損傷を感受し、細胞外にグルタミン酸を放出し、細胞内カルシウムシグナルを発生させるメカニズムを有しているかもしれない。
GFP型張力センサーについては、細胞壁をターゲットした結合タンパク質ドメインの選抜を行った。また、GFPの蛍光センサードメインと結合タンパク質ドメインを接続するためのリンカーのアミノ酸の種類や長さなどの最適化を行い、in vitroで蛍光観察が可能であることを確認した。
持ち運びができ、任意の角度から蛍光イメージングができる広視野・ポータブルカメラ・蛍光イメージングシステムは、概ね完成し、タバコなどの大きな植物体を用いた蛍光観察が可能となった。
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| Strategy for Future Research Activity |
植物細胞におけるマイクロメートルオーダーの力学的刺激（微小な傷害刺激）を感受するメカニズムに関しては、新しい細胞レベルでの傷害感知機構モデルの提唱を目指す。張力センサーに関しては、蛍光センサードメインおよびリンカー全体の最適化を行いながら、in vitroでの細胞壁成分への結合能を解析する。広視野・ポータブルカメラ・蛍光イメージングシステムは、実際の大型植物体を用いた生理学的な研究へと移行していく。
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