Dynamic optimization strategy of plant structural unit learning from synthesis and degradation process of woody biomass

2020 Fiscal Year Annual Research Report

• Project Area: Elucidation of the strategies of mechanical optimization in plants toward the establishment of the bases for sustainable structure system
• Project/Area Number: 18H05494
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 五十嵐 圭日子 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 准教授 (80345181)
• Project Period (FY): 2018-06-29 – 2023-03-31
• Keywords: セルロース / セルラーゼ

Outline of Annual Research Achievements

生合成（biosynthesis）レベルの実験としては、昨年までに得られた宇宙空間で合成した酵素合成セルロースゲルの構造をより詳細に解析する為、小角・広角X線散乱法によるゲル構造の分析を試みた。また分析に先立ち、コンフォーカルサイエンス社と共同し、新たに石英ガラスを用いた反応容器の設計を行った。現在までに、新しい反応容器を用いた宇宙空間での新たなセルロースゲル調製までを完了しており、電子線散乱実験を進めている。また昨年までに作成したセルロースナノクリスタル合成酵素CDPのシステイン→セリン残基変異による安定変異体の安定化メカニズムを解明する為、調製した安定変異体の結晶構造を解明し解像度2.0Åでの立体構造情報の取得に成功した。さらに解析の結果、調製したCDP安定変異体は野生型酵素では二量体→単量体へと重合体構造が変化していることを明らかにした。現在はさらにセルロースを合成中のCDP酵素の形態を明らかにする事を目的にクライオ電子顕微鏡での解析にも取り組んでおり、これまでに野生型酵素のみの状態で解像度3.0Åの構造取得に成功している。
また生分解（biodegradation）に関する研究としては、セルロース分解性細菌由来セルラーゼの高速原子間力顕微鏡による動的可視化の結果から、プロセッシビティの獲得が蛋白質レベルの収斂進化によるものであることを提唱し、その成果を米国科学アカデミー紀要（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America　IF=9.412）に報告した。さらに生改変（biomodification）実験としては、トマトが生産するβ-ガラクトシダーゼおよび担子菌が生産するβ-ガラクタナーゼのX線結晶構造から、β-ガラクタンをエキソ型で分解する酵素の分子機構を明らかにした。モモ由来エクスパンシンの機能に関しても反応性をさらに深く調べたところ、キシランの分解活性を持つことが明らかとなってきた。

Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

細菌由来のセルロース分解酵素の研究は、セルラーゼの進化の話につながり米国科学アカデミー紀要（PNAS）に公開された。さらに、微小重力下でのセルロース合成実験に成功し、放射光施設においてデータ取得まで完了したことから、コロナ禍において当初の計画以上に進展したと言える。

Strategy for Future Research Activity

生合成（biosynthesis）レベルの実験としては、セロデキストリン加リン酸分解酵素（CDP）の逆反応によるセルロースナノクリスタル（CNC）の生成に対する重力の影響に注目してきた。本年度は、昨年度得られた宇宙空間で合成した酵素合成セルロースゲルの構造をより詳細に解析するため、さらに小角・広角X線散乱法によるゲル構造の分析を試みる。現在までに、新しい反応容器を用いた宇宙空間での新たなセルロースゲル調製までを完了しており、電子線散乱実験を進めている。また昨年までに作成したCDPのシステイン→セリン残基変異による安定変異体の結晶構造に関して成果報告をしていく予定である。現在、さらにセルロースを合成中のCDPのクライオ電子顕微鏡による構造解析にも取り組んでおり、これまでの実験で得られている解像度3.0Åの野生型酵素の構造に関しても報告していく。
また生分解（biodegradation）に関する研究としては、溶解性多糖モノオキシゲナーゼ（LPMO）によるセルラーゼの活性促進メカニズムを詳細に調べ、その結果を報告する。1950年にReeseによって提唱されたC1-Cx説および1970年代にErikssonが提唱した酸化促進のanswer paperとなる解析結果が出ている。モモ由来エクスパンシンの機能に関しても解析を継続していく予定である。

Research Products

• [Int'l Joint Research] University of Cambridge(英国)
  • Country Name: UNITED KINGDOM
  • Counterpart Institution: University of Cambridge
• [Int'l Joint Research] Aalto University(フィンランド)
  • Country Name: FINLAND
  • Counterpart Institution: Aalto University
• [Journal Article] Role of tryptophan 38 in loading substrate chain into the active-site tunnel of cellobiohydrolase I from Trichoderma reesei (2021)
  • Author(s): Nakamura, A., Kanazawa, T. Furuta, T., Sakurai, M., Saloheimo, M., Samejima, M., Koivula, A., Igarashi, K.
  • Journal Title: J. Appl. Glycosci. Volume: 68 Pages: 19-29
  • DOI: 10.5458/jag.jag.JAG-2020_0014
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Preparation of large-volume crystal of cellulase under microgravity to investigate the mechanism of thermal stabilization (2021)
  • Author(s): Yamaguchi, S., Sunagawa, N., Matsuyama, K., Tachioka, M., Hirota, E., Takahashi, S., Igarashi, K.
  • Journal Title: Int. J. Micrograv. Sci. Appl. Volume: 38 Pages: 380103
  • DOI: 10.15011/jasma.38.1.380103
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Unique active site and subsite features in the arabinogalactan-degrading GH43 exo-β-1,3-galactanase from Phanerochaete chrysosporium (2020)
  • Author(s): Matsuyama, K., Kishine, N., Fujimoto, Z., Sunagawa, N., Kotake, T., Tsumuraya, Y., Samejima, M., Igarashi, K., and Kaneko S.
  • Journal Title: J. Biol. Chem. Volume: 295 Pages: 18539-18552
  • DOI: 10.1074/jbc.RA120.016149
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] In vitro synthesis and self-assembly of cellulose II nanofibrils catalyzed by the reverse reaction of Clostridium thermocellum cellodextrin phosphorylase (2020)
  • Author(s): Pylkkanen, R., Mohammadi, P., Arola, S., de Ruijter, J. C., Sunagawa, N., Igarashi, K., and Penttila, M.
  • Journal Title: Biomacromolecules Volume: 21 Pages: 4355-4364
  • DOI: 10.1021/acs.biomac.0c01162
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Domain architecture divergence leads to functional divergence in binding and catalytic domains of bacterial and fungal cellobiohydrolases (2020)
  • Author(s): Nakamura, A. Ishiwata, D., Visootsat, A. Uchiyama, T., Mizutani, K., Kaneko, S., Murata, T., Igarashi, K., and Iino, R.
  • Journal Title: J. Biol. Chem. Volume: 295 Pages: 14606-14617
  • DOI: 10.1074/jbc.ra120.014792
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Convergent evolution of processivity in bacterial and fungal cellulases (2020)
  • Author(s): Uchiyama, T., Uchihashi, T., Nakamura, A., Watanabe, H., Kaneko, S., Samejima, M., and Igarashi K.
  • Journal Title: Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. Volume: 117 Pages: 19896-19903
  • DOI: 10.1073/pnas.2011366117
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Analysis of substrate-recognition mechanism of tomato β-galactosidase 4 using X-ray crystallography and docking simulation (2020)
  • Author(s): Matsuyama, K., Kondo, T., Igarashi, K., Sakamoto, T., and Ishimaru, M.
  • Journal Title: Planta Volume: 252 Pages: 72
  • DOI: 10.1007/s00425-020-03481-4
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] アセチルキシランに対するPhanerochaete chrysosporium由来キシラナーゼ二種の反応特性の比較解析 (2021)
  • Author(s): 小島圭輔、砂川直輝、五十嵐圭日子、Paul Dupree
  • Organizer: 第71回日本木材学会大会
• [Presentation] 担子菌Phanerochaete chrysosporium由来Cel6 CBHの熱安定化メカニズム解明を目指した宇宙空間での大型結晶化 (2021)
  • Author(s): 山口空、砂川直輝、松山佳織、古久保美樹、立岡美夏子、田仲広明、高橋幸子、広田恵理華、五十嵐圭日子
  • Organizer: 第71回日本木材学会大会
• [Presentation] コヘシンとドッケリンを用いた真菌セルラーゼの触媒ドメインとCBMの連結 (2020)
  • Author(s): 小川裕太郎、砂川直輝、五十嵐圭日子
  • Organizer: 第69回日本応用糖質科学会大会
• [Presentation] 加リン酸分解酵素を用いて合成したセルロースII結晶表面の原子レベル観察 (2020)
  • Author(s): 久我友大、砂川直輝、鮫島正浩、五十嵐圭日子
  • Organizer: 第69回日本応用糖質科学会大会
• [Presentation] セルラーゼの中性子構造から見える酵素におけるプロトンリレーの重要性 (2020)
  • Author(s): 五十嵐圭日子
  • Organizer: 第93回生化学会大会「タンパク質の高速分子動画撮影の汎用化に向けて 」
  • Invited
• [Presentation] 糖加水分解酵素の機能と形：セルラーゼを例に (2020)
  • Author(s): 五十嵐圭日子
  • Organizer: 令和２年度 日本応用糖質科学会東日本支部ミニシンポジウム「埼玉の糖鎖研究の新展開－見えない動きを観る新技術を糖鎖研究にどう生かすか－」
  • Invited
• [Presentation] 植物学のバイオエコノミートランスフォーメーション（BEX） (2020)
  • Author(s): 五十嵐圭日子
  • Organizer: 日本学術振興会産学協力研究委員会 地球環境・食糧・資源のための植物バイオ第160委員会 第12回研究会 「植物バイオ産業におけるバイオエコノミー」
  • Invited
• [Remarks] 枝をよけながら幹を切る:複雑な糖鎖を分解できる酵素のユニークな構造
  • URL: https://www.a.u-tokyo.ac.jp/topics/topics_20201027-2.html
• [Remarks] 蛋白質レベルの収斂進化によって微生物は結晶性セルロースを壊せるようになった
  • URL: https://www.a.u-tokyo.ac.jp/topics/topics_20200804-1.html