2018 Fiscal Year Annual Research Report
Decryption of the ubiquitin code by chemo-technologies and advanced proteomics
| Project Area | New frontier for ubiquitin biology driven by chemo-technologies |
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| Project/Area Number |
18H05498
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| Research Institution | Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science |
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Principal Investigator |
佐伯 泰 公益財団法人東京都医学総合研究所, 生体分子先端研究分野, 室長 (80462779)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
大竹 史明 公益財団法人東京都医学総合研究所, 生体分子先端研究分野, 主席研究員 (60447373)
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| Project Period (FY) |
2018-06-29 – 2023-03-31
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| Keywords | ユビキチン / プロテアソーム / p97 / ケモテクノロジー / 質量分析計 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ユビキチンの多彩な機能はユビキチン修飾の構造多様性に由来しており、その高次構造に内包された情報は「ユビキチンコード」と称されるに至っているが、その全体像を解明する研究はまだあまり進んでおらず、デコーダー分子の使い分けや機能連携も不明な点が多い。本計画研究では、ユビキチン解析に特化した様々な最先端プロテオミクス解析法を確立し、領域内で開発するケモテクノロジーを利用して、ユビキチンシグナルの根幹である「ユビキチン修飾の高次構造」の直接の解析と「デコーダー分子による識別・解読機構」の解明を目的とする。
１．最先端ユビキチン・プロテオミクス解析法の開発：質量分析計Orbitrap Fusion Lumosを所属研究機関に設置し、本機器のために開発された様々な最先端プロテオミクス解析法をユビキチン研究に導入した。まず、TMT10-plex/SPS-MS3法では世界トップレベルとなる約8,000タンパク質の網羅的変動解析の開発に成功した。また、X-link/MS3法を用いたp97コファクターNpl4とユビキチン鎖の相互作用部位決定やMiddle-down MS2法による分岐型ユビキチン鎖の識別などに成功した。
2．ユビキチンデコーダー分子のユビキチン鎖タイプ選択性の解析：プロテアソームのシャトル分子RAD23ファミリー、UBQLNファミリーについてsiRNAノックダウン時に蓄積するタンパク質をTMT10-plex/SPS-MS3法で解析した。その結果、基質プロファイルが大きく異なり、シャトル分子の使い分けが存在することが明確となった。
３．領域内共同研究：深井班、内藤班、岩井班と共同でE6-APやRAD23Bに対するステープルペプチドを開発した。また、吉田班と共同でユビキチン結合ドメインのリガンド探索を開始した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
最先端プロテオミクス解析を実現する最新鋭の質量分析計Orbitrap Fusion Lumosを所属研究機関に設置し、細胞試料を用いたユビキチン鎖の超高感度絶対定量、分岐型ユビキチン鎖の高次構造解析、ユビキチンデコーダーのユビキチン結合部位決定などに成功した。また、新規SNIPERやUbTACのリードアウトとして高深度のプロテオーム変動解析が必須となるが、サンプル調整法や機器のセッティングを最適化することで、約8,000タンパク質（現時点で世界トップレベル）の網羅的同定・相対定量解析を実現した。一方、領域内の共同研究により、ユビキチンリガーゼE6-APやシャトル分子RAD23Bとプロテアソームの相互作用を破壊するステープルペプチドを開発し、試験管内での評価までは進展している。さらに、14種類のUBA（ユビキチン結合）ドメインやK63鎖形成ユビキチンリガーゼに対する低分子化合物リガンドのスクリーニングも開始した。よって、当初の計画通り研究が進展しているといえる。
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| Strategy for Future Research Activity |
１．最先端ユビキチン・プロテオミクス解析法の開発：TMT10plex/SPS-MS3法について、イオンモビリティーインタフェースを導入し、世界No. 1の比較ディーププロテオミクス法を確立する。分岐型ユビキチン鎖の組成解析（Middle-down MS2）について、岡本班が開発する化学合成ユビキチンを内部標準とした絶対定量系を確立する。また、タンパク質相互作用部位決定法（DSSO Xlink/MS3）を試験管内の解析から細胞レベルに拡大しする。これらの新しい解析技術と従来のユビキチン鎖絶対定量法を用いて、領域内の各種共同研究を実施する。
２．分岐型ユビキチン鎖の機能解析：分岐鎖を形成するユビキチンリガーゼを新規に同定しており、分岐鎖形成のメカニズム解明と細胞機能の解析を進めるとともに、岡本班が開発する化学合成分岐型ユビキチン鎖を用いて特異的デコーダー分子の探索を進める。
３．シャトル分子の機能解析および阻害剤開発：プロテアソームのシャトル分子の使い分けと機能連携について同定された基質タンパク質を中心に解析を進める。また、ステープルペプチドによるシャトル分子の機能阻害を並行して実施し、siRNAノックダウンとステープルペプチドによる機能阻害を比較解析する。
４．p97-UFD1-NPL4複合体の機能解析および阻害剤開発：ユビキチン依存的シャペロンp97はプロテアソーム依存的タンパク質分解経路、タンパク質輸送、選択的オートファジー、DNA修復、DNA複製など様々な細胞内経路を制御することが知られている。p97-UFD1-NPL4複合体のユビキチン化基質解きほぐし活性をモニターできる実験系を開発するとともに、p97のユビキチン結合コファクターUFD1-NPL4のタンパク質間相互作用を破壊する化合物を吉田班と共同でスクリーニングする。
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[Journal Article] Collided ribosomes form a unique structural interface to induce Hel2-driven quality control pathways.2019
Author(s)
Ikeuchi, K., Tesina, P., Matsuo, Y., Sugiyama, T., Cheng, J., Saeki, Y., Tanaka, T., Becker, T., Beckmann, R., and Inada, T.
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Journal Title
EMBO J.
Volume: 38
Pages: e100276
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Deubiquitylases USP5 and USP13 are recruited to and regulate heat-induced stress granules through deubiquitylating activities.2018
Author(s)
Xie, X., Matsumoto, S., Endo, A., Fukushima, T., Kawahara, H., Saeki, Y., and Komada, M.
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Journal Title
J. Cell. Sci.
Volume: 131
Pages: jcs210856
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] HERC2 facilitates BLM and WRN helicase complex interaction with RPA to suppress G-quadruplex DNA.2018
Author(s)
Wu, W., Rokutanda, N., Takeuchi, J., Lai, Y., Maruyama, R., Togashi, Y., Nishikawa, H., Arai, N., Miyoshi, Y., Suzuki, N., Saeki, Y., Tanaka, K., and Ohta, T.
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Journal Title
Cancer Res.
Volume: 78
Pages: 6371-6385
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Specific modification of aged proteasomes revealed by tag-exchangeable knock-in mice.2018
Author(s)
Tomita, T., Hirayama, S., Sakurai, Y., Ohte, Y., Yoshihara, H., Saeki, Y., Hamazaki, J., and Murata, S.
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Journal Title
Mol. Cell Biol.
Volume: 39
Pages: e00426-18
DOI
Peer Reviewed
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