2020 Fiscal Year Annual Research Report
Ubiquitin structural biology providing the molecular basis for chemo-technologies
| Project Area | New frontier for ubiquitin biology driven by chemo-technologies |
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| Project/Area Number |
18H05501
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
深井 周也 京都大学, 理学研究科, 教授 (10361792)
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| Project Period (FY) |
2018-06-29 – 2023-03-31
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| Keywords | 構造生物学 / 分子間相互作用 / ユビキチン / シグナル伝達 / タンパク質工学 / ケミカルバイオロジー / キメラ化合物 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ユビキチン修飾は、タンパク質分解のシグナルとしての役割にとどまらず、多様な細胞機能に必須な役割を担う。ユビキチン自身も修飾の対象であり、７ヶ所のリジン残基（K6、K11、K27、K29、K33、K48、K63）とN末端メチオニン（M1）のアミノ基を介して数珠つなぎになったユビキチン鎖として機能する例も多い。近年では、異なる鎖が混在する鎖（混合鎖）や、途中で分岐した鎖（分岐鎖）の存在に加えて、リン酸化などの翻訳後修飾がユビキチンに起きることも明らかになり、ユビキチン修飾系は想定を超えた複雑さを呈してきている。本研究では、特定のユビキチン鎖を選択的に認識するユビキチン結合ドメインや脱ユビキチン化酵素の立体構造解析により、新規の鎖タイプ選択的な認識機構を解明する。また、研究領域内で創出される機能性化合物の作用機構解明に必要な立体構造解析を行う。プロテアソーム分解系でK48鎖を認識するNpl4は、Ufd1と共に、unfoldase活性を持つ六量体ATPase p97/Cdc48のコファクターとして機能する。Npl4とUfd1との相互作用の阻害は、プロテアソーム阻害と同様にがんを抑える可能性が考えられる。今年度は、計画研究の都医学研・佐伯博士との共同研究で決定したNpl4-Ufd1複合体の結晶構造に基づいて、公募研究の静岡大・鳴海博士との共同研究で阻害ペプチド化合物を設計・合成して、その阻害活性を検討した。また、公募研究の名大・林博士が開発した人工ユビキチン結合分子の相互作用機構を明らかにするための構造解析を行なった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Npl4とUfd1との相互作用の阻害ペプチド化合物の開発に関しては、出芽酵母由来Npl4に結合するUfd1ペプチドを基にして、立体構造的に最重要と考えられる領域を抽出した上で、ジスルフィド結合やクロロアルケン骨格の導入によるNpl4結合コンフォメーションの安定化と親和性の向上を試みた。しかしながら、設計したペプチド化合物はプルダウンアッセイで阻害効果を示さなかった。そこで、出芽酵母由来のNpl4とヒト由来のNpl4について、阻害に必要なUfd1の最小領域を決定することにした。決定した最小領域のペプチドは、これまでに報告していたUfd1のNpl4結合領域と同等の親和性を持つことが確認できた。
領域内で開発された分子ツールの研究として、名大・林博士が開発した人工ユビキチン結合分子とユビキチンとの複合体の結晶構造を決定して、その相互作用機構を明らかにした。多くのユビキチン結合ドメインが認識するIle44を中心とする疎水性パッチとの相互作用が見られた。昨年度までに行なっていた研究については、炎症シグナル経路で機能するTAB2とK6鎖との複合体の構造解析の論文を投稿して現在査読中であり、また、プロテアソーム分解を制御するUBE3A-PSMD4複合体については機能解析が進行中である。さらに、これまでの共同研究に加えて、オートファジー関連のユビキチンシグナルの構造研究を計画研究の都医学研・山野博士と開始した。以上の状況から、概ね順調に進展していると判断する。
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| Strategy for Future Research Activity |
ヒトと出芽酵母ではUfd1の配列保存性が低く、Npl4との結合に必要なアミノ酸残基の情報が不足しているので、今後は、各アミノ酸残基をアラニン残基に置換して、各残基の親和性への寄与を解析する。結合に必須のアミノ酸残基を維持しながら、さらに親和性や安定性を向上させるような修飾を導入する。並行して、細胞での動態・安定性の解析も含めて、細胞レベルでの効果を検証する。
領域内の共同研究では、人工ユビキチン結合分子以外にも、分子ツールの機能メカニズムを理解するための結晶構造解析の提案も受けているので、それらも積極的に推し進める。また、オートファジー関連のユビキチンシグナルに関わる分子群の結晶構造解析を進める。
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