Chemical biology for controlling ubiquitin function

2020 Fiscal Year Annual Research Report

• Project Area: New frontier for ubiquitin biology driven by chemo-technologies
• Project/Area Number: 18H05503
• Research Institution: Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 吉田 稔 国立研究開発法人理化学研究所, 環境資源科学研究センター, 副センター長 (80191617)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 近藤 恭光 国立研究開発法人理化学研究所, 環境資源科学研究センター, 専任研究員 (80333342) ; PRADIPTA AMBARA 東京工業大学, 物質理工学院, 助教 (90631648)
• Project Period (FY): 2018-06-29 – 2023-03-31
• Keywords: 化合物アレイ / ユビキチンリガーゼ / E3リガンド / UbTACs / ライブラリー合成 / クリック反応 / アジド / アルキン

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、ケモテクノロジーを駆使して、ユビキチン修飾系を理解し、操作する新たな方法論を開拓しようとしている。その中心となる技術は、UbTACsと名付けた新たなユビキチン化誘導キメラ分子である。UbTACs創製を目的に様々なE3リガーゼの新規リガンドを探索するため、独自技術である化合物アレイを活用する。
2020年度は、膜タンパク質輸送を制御するユビキチンリガーゼであり、K63 鎖を特異的に形成する NEDD4 に結合するE3リガンドとして同定した1種の化合物がキメラ化合物への誘導化が可能な官能基を有することを明らかにし、モデル系のキメラ化合物として、Haloリガンドとのキメラ化合物を合成したが、ユビキチン化誘導活性は見られなかった。そこで、NEDD4全長タンパク質を用いて新たに化合物スクリーニングを実施し、5種のヒット化合物を得た。そのうちの1化合物において、NEDD4のユビキチン化活性を増強する活性を有することを見出した。また、CFTR関連E3リガーゼおよびプロテアソームサブユニットについても化合物アレイスクリーニングを実施し、ヒット化合物を得た。効率よくキメラ化する方法として、アジドとアルキンを用いたクリック法を利用し、ヒストン脱アセチル化酵素HDAC6阻害剤とのキメラ化合物を合成した。その結果、本化合物によって細胞内のHDAC6が効率よく分解されることを確認した。さらにがん細胞で蓄積する代謝物アクロレインと選択的に反応するアリルアジドを利用して、がん細胞内でカルベンを中間体として生成させ、がん細胞内のタンパク質と共有結合させることに成功した。また、数万化合物のライブラリーを用いてユビキチンに特異的に結合するデコーダー分子とユビキチンとの相互作用を阻害する化合物の探索を行い、Rpn10, Rpn13, HOIL-1Lのデコーダー阻害剤候補を同定した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究では、新規のE3リガンド及び標的タンパク質リガンドを探索し、それらを組織的にキメラ化してUbTACsを創製する計画であり、そのためにはクリック反応等を利用した効率的なキメラ化技術が必要となる。そこで、研究当初からそのための基盤を構築するため、E3であるセレブロンのリガンドとして知られているサリドマイドに各種長さのリンカーを介してアジド基を導入した方法を確立した。2020年度は、その有効性を検証するため、HDAC6の酵素阻害剤とキメラ化することにより、HDAC6を分解できる新規キメラ化合物の創製に成功したので、さらにHDAC6のユビキチン結合ドメインであるZnF-UBPを利用した新たなキメラ化合物の創製に着手した。また、新たなE3リガンドの探索に関しては、NEDD4リガンドの化合物アレイによる探索、結合親和性の解析、それらの構造類縁化合物を用いて構造活性相関研究を行い、キメラ化合物への誘導化が可能なリガンドを明らかにしたが、細胞内での効果が見られなかったことから、NEDD4全長タンパク質を用いて新たにリガンド探索を行い、in vitroでNEDD4のユビキチン化活性を増強する化合物を見出している。また、CFTR関連E3リガーゼおよびプロテアソームタンパク質についても、領域内の計画班員、公募班員と共同でスクリーニングを実施し、ヒット化合物を得ている。さらに特定のタンパク質を標的とするPROTACsの概念とは異なり、がん細胞内で強くユビキチン化を誘導する方法として代謝物アクロレインを標的としたキメラ化合物の合成にも成功した。２分子蛍光補完法を用いた評価系により、ユビキチンデコーダー阻害剤探索を開始し、3種類の系で候補化合物を同定した。このように、当初の計画通り、おおむね順調に進展している。

Strategy for Future Research Activity

NEDD4全長タンパク質を用いた化合物アレイスクリーニングから得られたNEDD4リガンド候補化合物の活性、特異性、有用性を検証し、有効性が確認されればキメラ化を実施する。NEDD4のユビキチン化活性を増強した化合物は、純品でなく、化学混合物であるため、活性本体の同定を試みる。さらに、CFTR関連E3リガーゼおよびプロテアソームタンパク質のリガンド候補については、タンパク質との結合活性や酵素活性への影響を評価し、リガンドの絞り込みを行なっていく。必要に応じて、新たなリガンド候補化合物の化合物アレイ法及び最新技術であるマイクロスケール熱泳動法による探索を実施する。さらに、領域内の共同研究を拡大し、新たなリガンド候補化合物の化合物アレイによる探索を実施する。得られた候補化合物については、結合解析、構造活性相関研究を行い、キメラ化するためのリガンド化合物の特定を行っていく。ユビキチン関連分子とデコーダーの結合を制御する新たな化合物の探索系として確立したGaussiaルシフェラーゼの２分子蛍光補完法を活用し、広範なスクリーニングを継続する。得られた候補化合物の容量依存性試験、特異性試験（カウンターアッセイ）を実施するとともに生理活性の検証を開始する。

Research Products

• [Journal Article] Spliceostatin A interaction with SF3B1 limits U1 snRNP availability and causes premature cleavage and polyadenylation. (2021)
  • Author(s): Yoshimoto, R., Chhipi-Shrestha, J.K., Schneider-Poetsch, T., Furuno, M., Burroughs, A.M., Noma, S., Suzuki, H., Hayashizaki, Y., Mayeda, A., Nakagawa, S., Kaida, D., Iwasaki, S., Yoshida, M.
  • Journal Title: Cell Chem. Biol. Volume: - Pages: -
  • DOI: 10.1016/j.chembiol.2021.03.002
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Mechanism-based inhibitors of SIRT2: structure-activity relationship, X-ray structures, target engagement, regulation of α-tubulin acetylation and inhibition of breast cancer cell migration. (2021)
  • Author(s): Nielsen, A. L., Rajabi, N., Kudo, N., Lundo, K., Moreno-Yruela, C., Baek, M., Fontenas, M., Lucidi, A., Madsen, A. S., Yoshida, M., Olsen, C. A.
  • Journal Title: RSC Chem. Biol. Volume: 2(2) Pages: 612-626
  • DOI: 10.1039/D0CB00036A
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Chemical reversal of abnormalities in cells carrying mitochondrial DNA mutations. (2021)
  • Author(s): Kobayashi, H., Hatakeyama, H., Nishimura, H., Yokota, M., Suzuki, S., Tomabechi, Y., Shirouzu, M., Osada, H., Mimaki, M., Goto, Y., Yoshida, M.
  • Journal Title: Nat. Chem. Biol. Volume: 17(3) Pages: 335-343
  • DOI: 10.1038/s41589-020-00676-4
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] 機能低下したミトコンドリアを活性化させる化合物の発見. (2021)
  • Author(s): 小林大貴、吉田稔
  • Journal Title: 実験医学 Volume: 39(6) Pages: 954-957
• [Journal Article] Targeted 1,3-dipolar cycloaddition with acrolein for cancer prodrug activation (2021)
  • Author(s): Pradipta, A. R., Ahmadi, P., Terashima, K., Muguruma, K., Fujii, M., Ichino, T., Maeda, S., Tanaka, K.
  • Journal Title: Chem. Sci. Volume: - Pages: -
  • DOI: 10.1039/D0SC06083F
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Application of acrolein imines to organic synthesis, biofunctional studies, and clinical practice (2021)
  • Author(s): Pradipta, A. R., Tanaka, K.
  • Journal Title: Chem. Rec. Volume: 21 Pages: 646-662
  • DOI: 10.1002/tcr.202000146
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Splicing modulators elicit global translational repression by condensate-prone proteins translated from introns. (2020)
  • Author(s): Chhipi-Shrestha, J.K., Schneider-Poetsch, T., Suzuki, T., Mito, M., Khan, K., Dohmae, N., Iwasaki, S., and Yoshida, M.
  • Journal Title: bioRxiv, Volume: - Pages: -
  • DOI: 10.1101/2020.11.23.393835
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Genome-wide survey of ribosome collision. (2020)
  • Author(s): Han, P., Shichino, Y., Schneider-Poetsch, T., Mito, M., Hashimoto, S., Udagawa, T., Kohno, K., Yoshida, M., Mishima, Y., Inada, T., Iwasaki, S.
  • Journal Title: Cell Rep. Volume: 31(5) Pages: 107610
  • DOI: 10.1016/j.celrep.2020.107610
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Peanut skin extract ameliorates the symptoms of type 2 diabetes mellitus in mice by alleviating inflammation and maintaining gut microbiota homeostasis. (2020)
  • Author(s): Xiang, L., Wu, Q., Osada, H., Yoshida, M., Pan, W., Qi, J.
  • Journal Title: Aging (Albany NY) Volume: 12(14) Pages: 13991-14018
  • DOI: 10.18632/aging.103521
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] A novel GSK3 inhibitor that promotes self-renewal in mouse embryonic stem cells. (2020)
  • Author(s): Kobayashi, H., Nishimura, H., Kudo, N., Osada, H., Yoshida, M.
  • Journal Title: Biosci. Biotechnol. Biochem. Volume: 84(10) Pages: 2113-2120
  • DOI: 10.1080/09168451.2020.1789445
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] LUBAC accelerates B-cell lymphomagenesis by conferring resistance to genotoxic stress on B cells. (2020)
  • Author(s): Jo, T., Nishikori, M., Kogure, Y., Arima, H., Sasaki, K., Sasaki, Y., Nakagawa, T., Iwai, F., Momose, S., Shiraishi, A., Kiyonari, H., Kagaya, N., Onuki, T., Shin-Ya, K., Yoshida, M., Kataoka, K., Ogawa, S., Iwai, K., Takaori-Kondo, A.
  • Journal Title: Blood Volume: 136(6) Pages: 684-697
  • DOI: 10.1182/blood.2019002654
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] 血液脳関門透過性を有するヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の探索. (2020)
  • Author(s): 住吉孝明、平中誠弥、出口芳春、伊藤昭博、吉田稔
  • Journal Title: MEDCHEM NEWS Volume: 30(1) Pages: 43-46
• [Journal Article] A strategy for tumor targeting by higher-order glycan pattern recognition: Synthesis and in vitro and in vivo properties of glycoalbumins conjugated with four different N-glycan molecules (2020)
  • Author(s): Smirnov, I., Sibgatullina, R., Urano, S., Tahara, T., Ahmadi, P., Watanabe, Y., Pradipta, A. R., Kurbangalieva, A., Tanaka, K.
  • Journal Title: Small Volume: 16 Pages: 2004831
  • DOI: 10.1002/smll.202004831
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Disease-associated acrolein: A possible diagnostic and therapeutic substrate for in vivo synthetic chemistry (2020)
  • Author(s): Muguruma, K., Pradipta, A. R., Ode, Y., Terashima, K., Michiba, H., Fujii, M., Tanaka, K.
  • Journal Title: Bioorg. Med. Chem. Volume: 28 Pages: 115831
  • DOI: 10.1016/j.bmc.2020.115831
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Methods for acrolein detection: Recent advances and applications (2020)
  • Author(s): Pradipta, A. R., Tanaka, K.
  • Journal Title: J. Idn. Chem. Soc. Volume: 3 Pages: 73-80
  • DOI: 10.34311/jics.2020.03.2.73
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Enantioselective synthesis of cyclic and linear diamines by iminocycloaddition (2020)
  • Author(s): Chang, T. C., Pradipta, A. R., Tanaka, K.
  • Journal Title: Chirality Volume: 32 Pages: 1160-1168
  • DOI: 10.1002/chir.23265
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Discovery of small-molecule modulator of heterotrimeric G i-protein by integrated phenotypic profiling and chemical proteomics. (2020)
  • Author(s): Kawamura, T., Futamura, Y., Shang, E., Muroi, M., Janning, P., Ueno, M., Wilke, J., Takeda, S., Kondoh, Y., Ziegler, S., Watanabe, N., Waldmann, H., Osada, H.
  • Journal Title: Bioscience Biotechnology and Biochemistry Volume: 84 Pages: 2484-2490
  • DOI: 10.1080/09168451.2020.1812375
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Pesticide treatment reduces hydrophobic pollutant contamination in Cucurbita pepo through competitive binding to major latex-like proteins. (2020)
  • Author(s): Fujita, K., Kondoh, Y., Honda, K., Haga, Y., Osada, H., Matsumura, C., Inui, H.
  • Journal Title: Environmental Pollution Volume: 266 Pages: 115179
  • DOI: 10.1016/j.envpol.2020.115179
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Interaction between goniothalamin and peroxisomal multifunctional enzyme type 2 triggering endoplasmic reticulum stress. (2020)
  • Author(s): Sophonnithiprasert, T., Aruksakunwong, O., Tashiro, E., Kondoh, Y., Muroi, M., Osada, H., Imoto, M., Watanapokasin, R.
  • Journal Title: Heliyon Volume: 6 Pages: e05200
  • DOI: 10.1016/j.heliyon.2020.e05200
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Miclxin, a novel MIC60 inhibitor, induces apoptosis via mitochondrial stress in β-catenin mutant tumor cells. (2020)
  • Author(s): Ikeda, H., Muroi, M., Kondoh, Y., Ishikawa, S., Kakeya, H., Osada, H., Imoto, M.
  • Journal Title: ACS Chemical Biology Volume: 15 Pages: 2195-2204
  • DOI: 10.1021/acschembio.0c00381
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Inhibition of mitochondrial complex I by the novel compound FSL0260 enhances high salinity-stress tolerance in Arabidopsis thaliana. (2020)
  • Author(s): Sako, K., Futamura, Y., Shimizu, T., Matsui, A., Hirano, H., Kondoh, Y., Muroi, M., Aono, H., Tanaka, M., Honda, K., Shimizu, K., Kawatani, M., Nakano, T., Osada, H., Noguchi, K., Seki, M.
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 10 Pages: 8691
  • DOI: 10.1038/s41598-020-65614-9
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] HP1αクロモドメインを用いたFRET型蛍光プローブによる細胞分裂中のヒストン修飾動態の観察 (2021)
  • Author(s): 佐々木和樹、鈴木律裕、中尾 洋一、吉田 稔
  • Organizer: 第14回日本エピジェネティクス研究会年会
• [Presentation] 天然物化学ゲノミクスによる真核生物セントラルドグマの制御機構解析 (2021)
  • Author(s): 吉田稔
  • Organizer: 第14回日本エピジェネティクス研究会年会
  • Invited
• [Presentation] 細胞分裂過程におけるHP1αクロモドメインとヒストンH3の結合状態の経時観察 (2021)
  • Author(s): 佐々木和樹、鈴木律裕、中尾 洋一、吉田 稔
  • Organizer: 日本農芸化学会2021年度大会
• [Presentation] 分裂酵母のオキシリピンを介した窒素代謝に関わる細胞間コミュニケーションの解明 (2021)
  • Author(s): 橋本莉央、八代田陽子、大澤晋、平井剛、森山裕充、吉田 稔
  • Organizer: 日本農芸化学会2021年度大会
• [Presentation] mTOR経路阻害でリー脳症モデルNdufs4 KOマウス寿命を延長する分子機構 (2021)
  • Author(s): 伊藤孝、小林大貴、吉田稔
  • Organizer: J-mit 特別 オンラインシンポジウム
• [Presentation] 機能低下したミトコンドリアを活性化させる化合物の発見とその応用 (2021)
  • Author(s): 小林大貴、畠山英之、伊藤孝、西村はる菜、横田睦美、鈴木禎史、苫米地由里、白水美香子、長田裕之、三牧正和、後藤雄一、吉田稔
  • Organizer: J-mit 特別 オンラインシンポジウム
• [Presentation] Reactivity of Acrolein Released from Cancer Cells: Application for Selective Cancer Therapy and Diagnosis (2021)
  • Author(s): Pradipta Ambara Rachmat, Ahmadi Peni, Tanaka Katsunori
  • Organizer: 日本化学会第101春季年会
• [Presentation] Reactivity of Endogenous Acrolein: Application for Therapy and Diagnosis (2021)
  • Author(s): Pradipta Ambara Rachmat
  • Organizer: 新学術領域「ケモユビキチン 」第4回総括班会議
• [Presentation] 汚染物質輸送因子Major latex-like proteinの遺伝子発現と結合活性の制御によるウリ科作物汚染の低減化 (2021)
  • Author(s): 藤田健太郎、近藤恭光、本田香織、羽賀雄紀、長田裕之、松村千里、乾秀之
  • Organizer: 日本農薬学会第46回大会
• [Presentation] A new paradigm of eukaryotic mitochondrial genetic inheritance revealed from studies on yeast mitochondrial DNA replication (2020)
  • Author(s): Ling Feng, Yoshida Minoru
  • Organizer: 第43回日本分子生物学会年会
• [Presentation] Splicing modulators elicit global translational repression by condensate-prone proteins translated from introns (2020)
  • Author(s): Chhipi Shrestha Jagat Krishna, Schneider-Poetsch Tilman, Suzuki Takehiro, Mito Mari, Khan Khalid, Dohmae Naoshi, Iwasaki Shintaro, Yoshida Minoru
  • Organizer: 第43回日本分子生物学会年会
• [Presentation] Discovery of a small molecule that rescues phenotypes of cells carrying disease- related mitochondrial DNA mutations by inducing metabolic redirection (2020)
  • Author(s): Minoru Yoshida
  • Organizer: Target 2035 | a probe for every protein | Kick-off webinar series
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Hippo経路におけるYAP-TEAD相互作用を標的とした阻害剤探索 (2020)
  • Author(s): 高瀬翔平、長田裕之、吉田稔、伊藤昭博、
  • Organizer: 第24回日本がん分子標的治療学会学術集会
• [Presentation] エピジェネティクスリーダータンパク質GAS41の阻害剤探索 (2020)
  • Author(s): 高瀬翔平、高橋未帆、園田健、菊地正樹、近藤恭光、梅原崇史、長田裕之、吉田稔、伊藤昭博
  • Organizer: 第93回日本生化学会大会
• [Presentation] 化合物の標的分子同定のためのケミカルゲノミクス基盤の確立 (2020)
  • Author(s): 八代田陽子、Lien Pham、Sheena Li、Urvi Bhojoo、吉村麻美、木村寛美、河村優美、長田裕之、松本健、吉田稔、Jason Moffat、Charles Boone
  • Organizer: 新学術領域研究「化学コミュニケーションのフロンティア」第７回公開シンポジウム
• [Presentation] Reactivity and Application of Acrolein Released from Cancer Cells (2020)
  • Author(s): Pradipta Ambara Rachmat
  • Organizer: The 6th International Symposium on Applied Chemistry
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] がんが風編的に過剰生産するアクロレイン代謝物：ヒト生組織でのカスケード反応による乳がん術中迅速診断の臨床成果 (2020)
  • Author(s): Pradipta Ambara Rachmat, Tanei Tomonori, Morimoto Koji, Shimazu Kenzo, Noguchi Shinzaburo, Tanaka Katsunori
  • Organizer: 第62回天然有機化合物討論会
• [Presentation] Comprehensive detection of RNA targets that bind to chemical compounds using next-generation sequencing and data-driven method. (2020)
  • Author(s): Fujimoto Hayate, Kondoh Yasumitsu, Kawamura Tatsuro, Hase Sumitaka, Imoto Masaya, Osada Hiroyuki, Sakakibara Yasubumi
  • Organizer: RNA 2020 Meeting
  • Int'l Joint Research