2018 Fiscal Year Annual Research Report
| Project Area | Chromatin potential for gene regulation |
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| Project/Area Number |
18H05528
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| Research Institution | Kindai University |
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Principal Investigator |
山縣 一夫 近畿大学, 生物理工学部, 准教授 (10361312)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
原口 徳子 国立研究開発法人情報通信研究機構, 未来ICT研究所フロンティア創造総合研究室, 主任研究員 (20359079)
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| Project Period (FY) |
2018-06-29 – 2023-03-31
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| Keywords | 細胞核 / 人工核 / クロマチン / ライブセルイメージング / 哺乳動物受精卵 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、DNAやヒストンなど特定要素（群）を用いて初期胚内に人工核を創出する再構成技術、生きたまま適時にエピゲノム編集を行う技術を開発し、それらと計測技術を組み合わせることで、初期胚核が機能性を獲得していく機序を理解することを目的とする。本年度は、人工核の創出に関しては、作製したDNAビーズをマウス受精卵に導入する方法の検討を進め、マイクロインジェクションにより複数個のDNAビーズを受精卵に高効率で導入する系を確立した。また、生きた受精卵・胚でDNAビーズの動きを長時間蛍光観察した後に、その受精卵を仮親に移植し、産仔を得ることにも成功した。マウス受精卵に導入したDNAビーズが「どれくらい」核として振る舞うかについて、ライブセルイメージングや電子顕微鏡を用いて計測し、その計測データを定量化する試みを進めた。ビーズに結合させる要素（タンパク質）として、核膜孔複合体タンパク質（ヌクレオポリン）を検討した。ヌクレオポリンのうち、Nup133ビーズとNup153ビーズをヒト体細胞に導入して、その核膜および核膜孔複合体集合能力の有無を調べたところ、どちらのタンパク質にも、程度には差があるものの、核膜や核膜孔を集合させる能力があることが分かった。また、ビーズだけなく、細胞から分離した核をマウス受精卵に導入し、核としての機能の有無を評価した。凍結状態のマンモス死体から分離した核をマウス受精卵へ導入したところ、マンモス核が、第一分裂の際に、分裂期染色体を形成できることを発見した。エピゲノム編集に関しては、独自に開発した方法を用いて、セントロメア領域のMinor satelliteにDNAメチル化を特異的に導入することに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
人工核の創出については当初目標にしていた基本的な実験系の開発に成功し、来年度には論文化の目処がついたため、順調に進行していると考える。エピゲノム編集に関しても、これまでのMajor satellite配列に加えてMinor satellite配列にも特異的にDNAメチル化導入できたことから、順調であると言える。上述の通り、本年度は、特に人工核の創出の過程で開発した方法論を応用することにより、マンモス細胞核の一部復活（再構築）に成功した。この研究では、シベリアの永久凍土から見つかったマンモスの冷凍死体より組織片を回収し、そこから細胞核様の構造物を探索、それらをマウス卵子に核移植し、その後の発生をライブセルイメージングで観察した。その結果、一部のマンモス核にヒストンの取り込みや紡錘体の形成、さらには分裂開始後に核様の構造を取るものがあった。本成果は、新鮮かつ貴重なマンモス冷凍死体と、われわれの人工核創出技術やライブセルイメージング技術が合わさってはじめて得られたものであり、世界的・歴史的にみても稀な研究である。また、細胞生物学と発生生物学、さらに古生物学を融合させたものであり、まさに分野横断的な研究であると言える。なお、本研究は数多くのメディアにも取り上げられ、Altimetricはひと月たたず2000を超えるなど、その社会的なインパクトは顕著であった。以上から、当初の計画以上に進展があったと判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
（１）人工核の創出
本年度検討したDNAビーズのマウス受精卵への導入法を用い、その後のヌクレオソームの形成、核膜・核膜孔複合体の形成、核内外移行機能の有無について蛍光イメージングや電子顕微鏡、光－電子相関顕微鏡を用いて解析する。天然核と比較することで、核としての完成度を定量化する。さらに、転写・複製を行う人工核の創出をめざす。転写に必要とされるリン酸化RNA polymerase IIなどの存在量を指標に、マウス初期胚の発生過程で転写活性が出現する条件について検討する。発生時期のいつ、どこで、どのくらいの転写が起こるか、DNAプロモーターやヒストン修飾レベルとの関係も調べる。複製に関しては、複製フォークタンパク質の局在を指標に同様の解析を行い、細胞核機能を獲得する機序を理解する。DNAビーズに加えて、ヌクレオソームビーズなどをマウス受精卵にマイクロインジェクションし核形成能や転写に与える影響を検討する。また、同様の試みについてマウス受精卵だけでなくヒト体細胞を用いてもすすめる。
（２）エピゲノム編集
すでに成功している染色体ペリセントロメア・セントロメアに存在するMajor, Minor satellite配列に加えて、染色体上に均一に存在しているリピート配列（LINEやIAP）、さらには単一遺伝子座に対してDNAメチル化の導入を試みる。その際、これまでのTALE法に加えて、CRISPR/dCAS9システムを用いる。さらに、同様の方法論を用いてヒストン修飾の編集や、思い通りのタイミングで編集する技術の開発も試みる。
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