2020 Fiscal Year Annual Research Report
| Project Area | Chromatin potential for gene regulation |
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| Project/Area Number |
18H05528
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| Research Institution | Kindai University |
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Principal Investigator |
山縣 一夫 近畿大学, 生物理工学部, 教授 (10361312)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
原口 徳子 大阪大学, 生命機能研究科, 特任教授 (20359079)
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| Project Period (FY) |
2018-06-29 – 2023-03-31
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| Keywords | 細胞核 / 人工核 / クロマチン / ライブセルイメージング / 哺乳動物受精卵 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、（１）DNAやヒストンなど特定要素（群）を用いて初期胚内に人工核を創出する再構成技術、（２）生きたまま適時にエピゲノム編集を行う技術を開発し、それらと（３）クロマチン計測技術を組み合わせることで、初期胚核が機能性を獲得していく機序を理解することを目的とする。（１）人工核の創出については、一昨年度までにプラスミドDNAを付着させたビーズを受精卵に導入することで、ヌクレオソーム構造を有し、核膜・核膜孔複合体で覆われた細胞核様構造を作り出すことに成功した（Suzuki et al., Sci Rep, 2019）。しかし、それらは核移行活性を持たず、完全な人工核を作製したとは言えなかった。そこで当該年度は、導入する要素を様々に変更した。その結果、Bacterial Artificial Chromosome（BAC）のような長鎖DNA（長さ約160 kbp）を受精直後の卵子に導入することで、核移行活性を持つ人工核を作製することに成功した。また、導入するDNAを、時期特異的に発現する「転写ユニット」（時期特異的プロモーター下流にGFP遺伝子をつないだ配列）とすることで、構築された人工核が転写能を有し、かつステージ特異的な発現制御を受けることも明らかにした。（２）エピゲノム編集については、受精卵における染色体セントロメア領域のMinor satellite配列に人為的にDNAメチル化を導入した場合、発生が４細胞期付近で停止することが明らかとなった。さらに詳細な解析の結果、G2期が遅延・停止していることがわかった。また、（３）クロマチン計測では、低侵襲性の超解像ライブセルイメージングシステムを構築し、マウス及びヒト胚の染色体の本数を生きたまま計測することに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
（１）人工核の創出については、これまで予定通りにマウス受精卵内で作製した人工核の正常性についてライブセルイメージングや電子顕微鏡を用いて解析をすすめ、一昨年度には論文化することができた。またいくつかの派生した成果に関しても同年に論文化した。当該年度は、核移行活性や転写活性を持つ人工核の創出に成功し、学会や研究会で発表することができた。現在、転写活性を持つ人工核に関して論文準備中であり、本年度中の公表を目指す。（２）エピゲノム編集については、現時点では当初予定だったCRISPR/dCASシステムを用いた方法においてTALE法ほどの配列特異的なDNAメチル化導入を実現することができていない。現在、DNA結合モジュールの改良に加えて、DNAメチル化酵素の各種変異体を用いて特異性や活性を制御する試みを進めている。一方で、受精卵においてセントロメア領域のMinor satellite配列に人為的にDNAメチル化を導入すると、４細胞期というごく初期に発生を強く阻害することが明らかとなった。さらに、それはG2期停止を引き起こしていることもわかった。現在、論文化を見据えてその分子レベルでのメカニズムや意義について最終的な検討を行っている段階である。（３）当該年度はこれら成果に加えて、超解像顕微鏡を用いて受精卵の長時間イメージングを行った後にもそれを移植すると問題なくマウスが生まれるという低侵襲な測定系の開発に成功し、それを用いてマウスやヒト胚の染色体を生きたまま観察し、その本数や構造を測定することに成功した。この成果はすでにBioRxivに投稿し、現在査読中である。以上から、人工核やエピゲノム編集に関しては当該年度では論文準備中の段階であるものの、クロマチン計測に関しては論文投稿に進んでいるため、研究はおおむね順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
以下、（１）人工核の創出、（２）エピゲノム編集、（３）クロマチン計測に関して、項目ごとに進捗と実施計画を述べる
（１）人工核の創出：昨年度はスタート物質にBAC等の長鎖DNAを用いることで受精卵内に核移行活性を持つ人工核を構築できた。しかし、いまだ必要な濃度や導入時期に関して詳細な条件等は不明である。そこで本年度は昨年度から引き続き核移行活性を有し、転写を行う完全な人工核の創出を目指す。スタート物質として長鎖DNAだけでなく、高分子ポリマーとの複合体なども検討する。転写能の検討には、木村宏計画研究が開発したリン酸化RNA polymerase IIの可視化技術や、蛍光モルフォリノRNA技術などを利用する。これら方法によって人工核において転写が見られたら、時期特異的プロモーターへの転写因子の結合や、そのエピジェネティック状況の違いなどを経時的に測定する。
（２）エピゲノム編集：上述の通り、すでにマウス受精卵において染色体セントロメアに存在するMinor satellite配列特異的に人為的にDNAメチル化を導入することに成功している。本年度は、エピゲノム編集を行った受精卵のその後の発生への影響を分子レベルでさらに詳細に検討するとともに、このシステムをES細胞の系に応用し、分化増殖への影響を解析する。
（３）クロマチン計測：2019年に報告された CRISPR法に基づいた特定遺伝子領域の可視化技術であるLIVE-FISH技術と、独自に開発した低侵襲性の超解像観察技術を組み合わせ、初期卵割時における染色体の構造をダメージなく詳細に計測する技術の開発を行った（論文投稿中）。本年度はこの技術を応用し、上記で検討する人工細胞核やエピゲノム編集後の細胞核の観察を行う。
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Research Products
(27 results)
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[Journal Article] Zygotic Nuclear F-Actin Safeguards Embryonic Development2020
Author(s)
Okuno Tomomi、Li Wayne Yang、Hatano Yu、Takasu Atsushi、Sakamoto Yuko、Yamamoto Mari、Ikeda Zenki、Shindo Taiki、Plessner Matthias、Morita Kohtaro、Matsumoto Kazuya、Yamagata Kazuo、Grosse Robert、Miyamoto Kei
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Journal Title
Cell Reports
Volume: 31
Pages: 107824
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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[Presentation] Asymmetrical localization of outer ring nucleoporins within the nuclear pore complex in fission yeast2020
Author(s)
Haruhiko Asakawa, Tomoko Kojidani, Atsushi Matsuda, Hui-Ju Yang, Chizuru Ohtsuki, Hiroko Osakada, Masaaki Iwamoto, Yuji Chikashige, Koji Nagao, Chikashi Obuse, Yasushi Hiraoka, Tokuko Haraguchi
Organizer
第43回日本分子生物学会年会
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