2019 Fiscal Year Annual Research Report
Dynamics of chromatin potential associating with cellular differentiation and its molecular mechanism
| Project Area | Chromatin potential for gene regulation |
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| Project/Area Number |
18H05530
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
眞貝 洋一 国立研究開発法人理化学研究所, 開拓研究本部, 主任研究員 (20211972)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
平谷 伊智朗 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, チームリーダー (40583753)
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| Project Period (FY) |
2018-06-29 – 2023-03-31
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| Keywords | クロマチンリモデリング / クロマチンドメイン / 核内コンパートメント |
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| Outline of Annual Research Achievements |
遺伝子発現は、ヌクレオソームレベルと細胞核レベル、そしてその中間に位置する「クロマチンドメイン」や「核内コンパートメント」と呼ばれるメガベース（Mb塩基）単位のクロマチン高次構造によって多階層的に制御される。このクロマチン高次構造は細胞分化に伴って変動し、クロマチンが潜在的にもつ転写の起こりやすさ（クロマチンポテンシャル）の変化と密接な関係があると考えられる。本研究では、マウス胚性幹細胞（ES 細胞）とそれを分化させた細胞を用いて、Mb 単位のクロマチン構造を制御する因子群の機能を明らかにすることで、細胞分化を実現するクロマチンポテンシャルの分子基盤を解明することを目的とする。
２０１９年度は、以下の研究を進めた。
眞貝は、クロマチンリモデリング因子によって如何に転写抑制のエピゲノムが動的に制御されているかを明らかにすることを目指している。今年度は、HELLS複合体の構成因子であるHELLS及びCDCA7のリコンビナントたんぱく質を用いて、HELLSのATPase活性の生化学的検討を行い、またDNMT3によるde novoメチル化におけるHELLS複合体の重要性を検証するためのHellsあるいはCdca7とDnmt3aあるいは3bのDKO ES細胞を樹立した。
平谷は、Mb単位のクロマチン構造の一つとして近年見出された核内コンパートメントの制御因子の網羅的探索を行い、その分子基盤を明らかにすることを目標にしている。今年度は、複製タイミングを生細胞で可視化できるレポーターシステムを完成させ、これを用いてレンチウイルス型全ゲノムgRNAライブラリーによるスクリーニングを実施するための予備実験を行い、２つのマウスES細胞レポーター株についてスクリーニング実験を実施した。得られた複製タイミング制御に関わる候補遺伝子リストには、核内コンパートメント制御因子が多く含まれていると期待している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
眞貝の担当である「クロマチンリモデリング因子によって如何に転写抑制のエピゲノムがダイナミックに制御されているか」を明らかにする研究では、クロマチンリモデリングHELLS複合体の構成因子HELLS,CDCA7とde novo DNAメチル化酵素DNMT3A, 3Bのリコンビナントたんぱく質調整も終わり、様々な生化学的解析も始まっている。さらに、de novoメチル化におけるHELLS複合体の重要性を検証するためのES細胞の樹立も終わり、いつでも機能相関の実験を開始できる状況にある。
平谷の担当である「Mb単位のクロマチン構造の一つとして近年見出された核内コンパートメントについて、その制御因子の網羅的探索を行い、核内コンパートメントの分子基盤を明らかにする」研究については、生細胞可視化レポーターシステムが完成し、網羅的スクリーニング実験の条件検討も首尾よく終え、現在、スクリーニング実験を実施中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
（1-1）継続して、昆虫細胞で産生したクロマチンリモデリング因子複合体・HELLS/CDCA7、DNAメチル化酵素Dnmt3a, 3b, 3Lを用いて、in vitro DNAメチル化におけるHELLS/CDCA7の役割をヌクレオソームを基質として生化学的に検討する（眞貝）。
(1-2)HellsあるいはCdca7を欠損させたDnmt3aあるいはDnmt3bの条件的欠損ES細胞を樹立したので、この細胞を使い、HELLSあるいはCDCA7がどれほどDntm3aあるいはbによるde novo DNAメチル化に重要であるかを解析する（眞貝）。
（1-3）A/Bコンパートメント形成におけるH3K9メチル化酵素の役割の解析をまとめ、論文化を目指す（眞貝/平谷）。
（2-2）昨年度は、複製時期の異なる４つのゲノム領域にGFP遺伝子をノックイン（KI）したGFP-KI型マウスES細胞が、複製時期を反映したGFP蛍光強度を示すことを様々な角度から確認し、CRISPR/Cas9 sgRNAライブラリーによる複製時期制御因子の網羅的スクリーニング実験計画を、未分化ES細胞を用いて初めて実行に移した。今年度は、網羅的スクリーニング実験を継続すると共に、得られた候補因子のリスト作成と絞り込みを行い、単独遺伝子欠損マウスES細胞を作製して、複製タイミング異常（Repli-seq解析）と核内コンパートメント異常（Hi-C解析）の有無を一つずつ検証していく（平谷）。
（2-3）2-2の計画を進める中で、遺伝子欠損マウスES細胞のHi-C解析とRepli-seq解析のプラットフォームを確立し、解析のストリームライン化を図る（平谷）。
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[Journal Article] The Eleanor ncRNAs activate the topological domain of the ESR1 locus to balance against apoptosis2019
Author(s)
Abdalla MOA, Yamamoto T, Maehara K, Nogami J, Ohkawa Y, Miura H, Poonperm R, Hiratani I, Nakayama H, Nakao M, *Saitoh N.
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Journal Title
Nat Commun
Volume: 10
Pages: 3778
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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