2020 Fiscal Year Annual Research Report
Dynamics of chromatin potential associating with cellular differentiation and its molecular mechanism
| Project Area | Chromatin potential for gene regulation |
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| Project/Area Number |
18H05530
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
眞貝 洋一 国立研究開発法人理化学研究所, 開拓研究本部, 主任研究員 (20211972)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
平谷 伊智朗 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, チームリーダー (40583753)
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| Project Period (FY) |
2018-06-29 – 2023-03-31
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| Keywords | クロマチンリモデリング / クロマチンドメイン / 核内コンパートメント |
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| Outline of Annual Research Achievements |
２０２０年度は、以下の研究を進めた。
眞貝は、１）クロマチンリモデリング因子によって如何に転写抑制のエピゲノムが動的に制御されているかを明らかにすることを目指している。また、２）H3K9メチル化並びにその修飾酵素がどれほどクロマチン３次元構造、特にヘテロクロマチンの形成に重要であるのか、どのような役割を持っているのか、明らかにすることも目標にしている。今年度、H3K9ジメチル化がどのようなメチル化酵素によって制御されいているのか、H3K9メチル化酵素がヘテロクロマチン形成に対してどれほど重要な機能を持っているか、その解析の前半の研究成果をまとめ、論文化した（Fukuda et al. Commun Biol 2021）。さらにその研究を完成させるために、H3K9メチル化を完全に消失させた不死化MEF細胞を樹立した。現在、Hi-C解析、光学顕微鏡並びに電子顕微鏡による解析を行い、H3K9メチル化完全消失細胞での核内のクロマチン３次元構造の詳細を解析している。
平谷は、Mb単位のクロマチン構造の一つとして近年見出された核内コンパートメントの制御因子の網羅的探索を行い、その分子基盤を明らかにすることを目標にしている。前年度には、独自の複製タイミングレポーターシステムを完成させ、これを用いてレンチウイルス型全ゲノムgRNAライブラリーによるスクリーニング実験を行なった。今年度は、この実験で得られた制御因子の候補リストの上位の遺伝子について、その単独変異体マウスES細胞を複数作製し、ゲノムワイド複製タイミング解析でスクリーニング実験結果の再現性を検討した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
眞貝の担当である「クロマチンリモデリング因子によって如何に転写抑制のエピゲノムがダイナミックに制御されているか」を明らかにする研究では、クロマチンリモデリングHELLS複合体の構成因子HELLS,CDCA7とde novo DNAメチル化酵素DNMT3A, 3Bのリコンビナントたんぱく質の調整法はすでに確立し、現在、クライオ電顕によるHELLS/CDCA7複合体の構造解析に向けたサンプル調製を進めている。また、H3K9メチル化を完全消失させた不死化MEF細胞の樹立も終わり、既にこの細胞でのクロマチン高次構造解析を多角的に進めている。
平谷の担当である「Mb単位のクロマチン構造の一つとして近年見出された核内コンパートメントについて、その制御因子の網羅的探索を行い、核内コンパートメントの分子基盤を明らかにする」研究については、生細胞可視化レポーターシステムによる網羅的スクリーニング実験を実施し、候補因子を得て、これらの遺伝子の単独変異体マウスES細胞を鋭意解析中であり、予定通りかそれ以上に研究が進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
（1-1）継続して、昆虫細胞で産生したクロマチンリモデリング因子複合体・HELLS/CDCA7、DNAメチル化酵素Dnmt3a, 3b, 3Lを用いて、in vitro DNAメチル化におけるHELLS/CDCA7の役割をヌクレオソームを基質として生化学的に検討する（眞貝）。
（1-3）HELLS/CDCA7の機能を推察するため、DNAあるいはヌクレオソームと会合させた状態のHELLS/CDCA7複合体の構造学的解析（クライオ電顕解析）を進める（眞貝）。
（1-4）A/Bコンパートメント形成におけるH3K9メチル化の役割を明らかにするため、H3K9メチル化完全消失iMEF細胞の解析を進め、論文化を目指す（眞貝/平谷）。
（2-2）昨年度は、複製時期がEarly S期のマウス8番染色体Rex1領域にGFP遺伝子をノックイン（KI）したGFP-KI型マウスES細胞を用いて、CRISPR/Cas9 sgRNAライブラリーによる複製時期制御因子の網羅的スクリーニング実験を行い、興味深い候補遺伝子リストを得た。今年度も引き続き、得られた候補因子の単独遺伝子欠損マウスES細胞の作製と、複製タイミング異常（Repli-seq解析）と核内コンパートメント異常の有無（Hi-C解析）の検証を続ける。時間的余裕があれば、Rex1以外の3領域のGFP-KI型マウスES細胞を用いたスクリーニング実験にもとりかかる（平谷）。
（2-3）2-2の計画を進めつつ、遺伝子欠損マウスES細胞のHi-C解析とRepli-seq解析のプラットフォームを確立する。中でも、少数細胞に適したHi-CプロトコールであるMicro-Cの系の確立を急ぐ（平谷）。
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