2019 Fiscal Year Annual Research Report
Establishment of in vitro spermatogenesis with high integrity
| Project Area | Ensuring integrity in gametogenesis |
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| Project/Area Number |
18H05546
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| Research Institution | Yokohama City University |
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Principal Investigator |
小川 毅彦 横浜市立大学, 生命医科学研究科, 教授 (50254222)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
鈴木 貴紘 国立研究開発法人理化学研究所, 生命医科学研究センター, 上級研究員 (00553661)
木村 啓志 東海大学, 工学部, 准教授 (40533625)
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| Project Period (FY) |
2018-06-29 – 2023-03-31
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| Keywords | 精子形成 / 器官培養 / 組織再構築 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
In vitroマウス精子形成の成功は、牛血清アルブミン製剤であるAlbuMAXを培養液に加えたことが重要な契機となった（Nature 2011）。実際、基礎培地αMEMにAlbMAXを加えただけの培養液で、マウス精子形成は精子幹細胞から誘導され、維持できる。すなわち、AlbuMAX中にはマウス精子形成のために必要なすべての栄養素・物質群が含まれていることになる。私たちは、AlbuMAXから抽出した脂溶性物質に精子形成誘導能のすべてが含まれていることを見いだし、メタボローム解析とリピドーム解析という網羅的解析技術を用いて、重要因子がビタミンEなどの抗酸化物質とリゾリン脂質であることを突き止めた。これにより化学組成が明らかな合成培地を用いての精子形成の誘導が可能となり、必要な因子のすべてが明らかとなった（FASEB J 2020）。抗酸化剤とリゾリン脂質はラットの精子形成にも有効であり、これまで不可能だったin vitroでの半数体産生が可能となった（未発表）。これは本研究の目的達成のためのマイルストーンであり、今後の進展の基盤となる。ただし、in vitroでの精子完成（半数体細胞が精子になるまでの形態変化と成熟）は不完全であり、今後の課題である。さらに私たちは、培養下の精巣組織と生体内精巣組織のトランスクリプトーム解析（マイクロアレイ）を行い、培養下特有の特徴の解析を行った。その結果、培養下では炎症反応・自然免疫の活性化が極めて高度に生じていることが明らかとなった（投稿準備中）。現在、single cell RNA-seqによる詳細な検討を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
AlbuMAX内に含まれる重要因子を同定することは、非常に困難な作業であり、これに一定の目途がたち、in vitro精子形成における重要因子がビタミンEなどの抗酸化物質とリゾリン脂質であることを突き止めたことは大きな進展だと考えている。実際、これにより化学組成が明らかな合成培地を用いての精子形成の誘導が可能となり、必要な因子のすべてが明らかとなった（FASEB J 2020）。また、抗酸化剤とリゾリン脂質はラットの精子形成にも有効であり、これまで不可能だったin vitroでの半数体産生が可能となった（未発表）。ラット精子形成の進展には勇気づけられており、毒性試験等への応用も現実化すると期待できる。また私たちは、培養下の精巣組織と生体内精巣組織のトランスクリプトーム解析（マイクロアレイ）、single cell RNA sequenceでの解析も進めており、今後に期待がもてる。マイクロ流体デバイスでの試行錯誤実験も繰り返しており、目立ったポジティブデータは無いが、今後に期待できるデータが出始めている。以上から、本研究の進捗は順調であると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでに、器官培養法によるin vitro精子形成の誘導に必要な物質群のほぼ全貌を明らかにした。しかし、精子完成（半数体細胞が精子になるまでの形態変化と成熟）過程は不完全である。現在、Step 11以降の精子細胞の核において蛍光物質Cherryを発現するトランスジェニックマウスを用意しており、精子完成に重要な培養液内の因子・物質をさらに探索する計画である。また、適度な酸素濃度が精子完成には重要であるとの実験データも得ており、その点も追及していく。
抗酸化剤とリゾリン脂質がラットの精子形成に有効であることを示すデータを得ている。ラット精巣を用いた実験に集中して理想的な培養液組成の開発に取り組む。
培養下でES細胞を連続的に分化誘導し、エピブラスト、中胚葉、生殖腺原基の順に形成する試みを行う。この分化誘導の指標となるマーカー遺伝子発現ベクターを組み込んだES細胞を計画研究１から供与して頂き、実験を開始した。まずはセルトリ細胞の作製を指標とする。機能的なセルトリ細胞の確認は、胎仔マウス精巣組織とのキメラによる精細管再構成実験と、Amh-Treckマウス精巣への移植とDT入り培地での培養により行う。セルトリ細胞以外の生殖腺細胞の産生を評価するために、single cell RNAseqを行う。最終的には、ES細胞から作製された細胞集団からのde novo再構成精巣を目指す。マウスで確立するその成果を、哺乳動物全般に応用できる普遍的な技術に発展させる。
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Research Products
(6 results)
