2020 Fiscal Year Annual Research Report
Establishment of in vitro spermatogenesis with high integrity
| Project Area | Ensuring integrity in gametogenesis |
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| Project/Area Number |
18H05546
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| Research Institution | Yokohama City University |
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Principal Investigator |
小川 毅彦 横浜市立大学, 生命医科学研究科, 教授 (50254222)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
鈴木 貴紘 国立研究開発法人理化学研究所, 生命医科学研究センター, 上級研究員 (00553661)
木村 啓志 東海大学, 工学部, 准教授 (40533625)
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| Project Period (FY) |
2018-06-29 – 2023-03-31
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| Keywords | 精子形成 / 器官培養 / 組織再構築 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
基礎培地αMEMにAlbMAXを加えただけの培養液で、マウスにおいては精子幹細胞からの精子産生が可能である。すなわち、AlbuMAX中にはマウス精子形成のために必要なすべての栄養素・物質群が含まれていることになる。私たちは、AlbuMAXから抽出した脂溶性物質に精子形成誘導能のすべてが含まれていることを見いだし、メタボローム解析とリピドーム解析という網羅的解析技術を用いて、重要因子がビタミンEなどの抗酸化物質とリゾリン脂質であることを突き止めた。これにより化学組成が明らかな合成培地を用いての精子形成の誘導が可能となり、必要な因子のすべてが明らかとなった（FASEB J 2020）。抗酸化剤とリゾリン脂質はラットの精子形成にも有効であり、これまで不可能だったin vitroでの半数体産生が可能となった（SciRep, 2021）。これは本研究の目的達成のためのマイルストーンであり、今後の進展の基盤となる。ただし、in vitroでの精子完成（半数体細胞が精子になるまでの形態変化と成熟）は不完全であり、今後の課題である。さらに私たちは、培養下の精巣組織と生体内精巣組織のトランスクリプトーム解析（マイクロアレイ）を行い、培養下特有の特徴の解析を行った。その結果、培養下では炎症反応・自然免疫の活性化が極めて高度に生じていることが明らかとなった（BBRC, 2020）。現在、single cell RNA-seqによる詳細な検討を進めている。また、精子形成を支える最も重要な体細胞はセルトリ細胞であり、セルトリ細胞の再生と機能制御が今後の研究の柱になると考えている。私たちは精細管内のセルトリ細胞を特異的に死滅させ、外から移植した新しいセルトリ細胞に置き換えることに成功した。それによりマウス精細管のセルトリ細胞をラットのセルトリ細胞で置換することに成功した（論文投稿中）。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
AlbuMAX内に含まれる重要因子は主として脂質であり、なかでもリゾリン脂質が重要であることを解明した。さらにin vitro精子形成を進める上でビタミンEなどの抗酸化物質も重要であることが明らかとなった。これにより化学組成が明らかな合成培地を用いての精子形成の誘導が可能となり、必要な因子の全貌が見えてきた（FASEB J 2020）。このことから、これまで進まなかった培養液の改良が可能となった。すなわちAlbuMAXを減量し、そこにリン脂質や抗酸化剤を加えた新しい培地により、これまで不可能だったラットでのin vitro精子形成において半数体産生が可能となった（SciRep 2021）。ラット精子形成の進展には勇気づけられており、ハムスターやマーモセットなどの多種動物への応用も視野に入ってきた。また私 たちは、培養下の精巣組織と生体内精巣組織のトランスクリプトーム解析（マイクロアレイ）、single cell RNA sequenceでの解析も進めており、今後に期待がもてる。マイクロ流体デバイスでの研究も継続しており、今後に期待できるデータが出始めている。以上から、 本研究の進捗は順調であると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
器官培養法によるin vitro精子形成の誘導に必要な物質群の概要が明らかになった。しかし、精子完成（半数体細胞が精子になるまでの形態変化 と成熟）過程は不完全である。培養液の更なる改良が必要であり、特に脂質組成に注目して研究をすすめて行く。そのためには、培養液と培養後の培養液の組成変化を詳細に解析することも必要であり、メタボローム解析を取り入れていく予定である。
ラット精巣を用いたin vitro精子形成は円形精子細胞の産生には成功しているが、伸長精子細胞への分化、さらには顕微授精での産仔産生を目指して研究を行う。ハムスターやマーモセットの精巣を用いた実験も展開する。
培養下でES細胞を連続的に分化誘導し、エピブラスト、中胚葉、生殖腺原基の順に形成する試みを行う。この分化誘導の指標となるマーカー遺伝子発現ベク ターを組み込んだES細胞を計画研究１から供与して頂き、実験を行っている。セルトリ細胞の作製を指標とし、その機能的な完成度をin vitro移植実験にて検定する予定である。
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Research Products
(9 results)
