2019 Fiscal Year Annual Research Report
種を越えた配偶子産生システムの in vitro 再構築
| Project Area | Ensuring integrity in gametogenesis |
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| Project/Area Number |
18H05548
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| Research Institution | National Institute for Physiological Sciences |
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Principal Investigator |
小林 俊寛 生理学研究所, 行動・代謝分子解析センター, 助教 (20587414)
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| Project Period (FY) |
2018-06-29 – 2023-03-31
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| Keywords | 始原生殖細胞 / 多能性幹細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
研究 1: PGC 発生に伴う遺伝子発現解析
ラットにおいて、PGCの成立・発生に重要であるPrdm14 の遺伝子座に H2BVenus をノックインしたレポーターを用いて、発生中における各ステージにおけるラット PGC の挙動を追跡した。さらに各ステージのラット PGC をセルソーターを用いて回収し、トランスクリプトーム解析を行い、PGC 発生過程における遺伝子発現の変化を明らかにした。併せて、PGC が出現する前の胚におけるエピブラストも併せてトランスクリプトーム解析を行い、エピブラストから PGC への分化に伴う変化も明らかになった。さらに Prdm14 の発現を完全に消失するノックアウトラットの解析を行うことで、ラットにおいてもマウス同様に Prdm14 が PGC の成立・発生に欠かせないことを明らかにした。以上の内容をまとめ、Development 誌に報告した (Kobayashi et al., Development (2020))。一方、ウサギでは、野生型ウサギの初期胚を用いたトランスクリプトーム解析も行い、研究 2 で用いる多能性幹細胞におけるトランスクリプトームの比較解析により用いる多能性幹細胞の状態を明確にした。
研究 2 ラットとウサギの多能性幹細胞からのin vitro PGC 誘導
前年度から引き続き、ラット・ウサギの多能性幹細胞を起点とした in vitro PGC 誘導法の確立に向け条件検討と最適化を行った。PGC 特異的なレポーター細胞や in vivo 胚での解析結果を参考にすることで、現在までにラット・ウサギ共に効率的に in vitro PGC が分化誘導できつつあり、遺伝子発現解析の結果、両者とも発生初期の PGC に極めて近い性質を持っていることが明らかになった。今後さらなる特性解析および in vivo での機能評価を進める。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
PGC 成立およびその発生機構について、マウスではこれまで多くの知見が積み重ねられその詳細が明らかになっていたが、ラットに関しては断片的な情報のみで、各発生ステージにおける挙動およびその遺伝子発現パターンですらほとんど明らかになっていなかった。しかし、申請者らの Prdm14 遺伝子改変ラットを用いた解析により、その動態を鮮明にすることに成功した。特にラット PGC のトランスクリプトーム解析結果をすでに報告のあるマウスおよびヒトの PGC のトランスクリプトームと種間比較することで、齧歯類間での保存性の高さを浮き彫りにすることができた (Kobayashi et al., Development (2020))。またウサギ PGC の方も in vivo 胚の解析を進めており、こちらは齧歯類よりもヒトに近いことが明らかになっている。これらの情報は、翌年度計画している in vitro PGC 分化誘導の発展に大きく貢献すると思われる。種を越えた in vitro 配偶子産生系を目指す本研究計画全体の基盤を構築できた点から、現在まで概ね順調に進展していると考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究 1: ラットとウサギの多能性幹細胞からのin vitro PGC 誘導
ラット・ウサギ多能性幹細胞由来の in vitro PGC について、更なる特性解析を進めると共に、機能評価として、in vitro PGC を生殖巣へ移植して、精子・卵子の作製を目指す。特にこれらを体外受精・顕微授精に用い、受精能と個体発生能を評価する。
研究 2: 転写因子を用いた分子基盤の解明
マウスやヒトでは PGC の成立・発生に重要な転写因子を多能性幹細胞に強制発現することで、サイトカイン非依存的に PGC を分化誘導できることが知られている。そこで研究 1 で確立された in vitro PGC 誘導系を用い、ラットやウサギの多能性幹細胞では、どのような転写因子の組み合わせが効率的に PGC へ分化誘導できるかを検討し、PGC 分化の分子基盤の共通性と種特異性を明らかにする。
研究 3. 動物種の特性を活かした in vitro gametogenesis の普遍性評価と新たな評価系の確立
ラットはマウスと近縁であるため、マウスで確立された in vitro gametogenesis の種を越えた適用性・普遍性を迅速に判断する指標となる。そこで他の計画研究と連携し、確立されたin vitro 卵子形成や精子形成の手法の、種を越えた普遍性を評価する。またラットは多能性幹細胞を用いることでマウスとの間で異種間キメラの作製が可能であるため、その特性を活かした新たな配偶子インテグリティの評価系確立を目指す。
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[Journal Article] Establishment of porcine and human expanded potential stem cells2019
Author(s)
Xuefei Gao, Monika Nowak-Imialek, Xi Chen, Dongsheng Chen, Doris Herrmann, Degong Ruan, Andy Chun Hang Chen, Melanie A Eckersley-Maslin, Shakil Ahmad, Yin Lau Lee, Toshihiro Kobayashi, et al
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Journal Title
Nature Cell Biology
Volume: 21
Pages: 687～699
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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