組織学的情報とリンクした単一細胞遺伝子発現プロファイル動態の解明

2018 Fiscal Year Annual Research Report

• Project Area: Ensuring integrity in gametogenesis
• Project/Area Number: 18H05553
• Research Institution: Nara Medical University
• Principal Investigator: 栗本 一基 奈良県立医科大学, 医学部, 教授 (20415152)
• Project Period (FY): 2018-06-29 – 2023-03-31
• Keywords: 単一細胞 / 1細胞 / Single cell / RNAseq / トランスクリプトーム / レーザーマイクロダイセクション / 組織学

Outline of Annual Research Achievements

凍結組織切片からの定量的単一細胞遺伝子発現を可能にする手法を開発するための実験系の構築を行った。この系においては、凍結組織切片から細胞を切り出すことによる情報の損失やバイアスを定量的に評価する必要がある。組織中の細胞は、血管との位置関係による物質の濃度など化学的環境、臓器や組織内での位置等による力学的環境の多様性により、本質的に不均一である。このため、切り出した細胞の遺伝子発現も原理的に不均一であり、そのバラツキから、方法論に起因する成分を抽出することは困難である。したがって本研究では均一な遺伝子発現を期待できる培養細胞（2iLIF存在下で培養したES細胞）を用いて疑似的な切片を作成し、そこから細胞を切り出してcDNA増幅に供し、方法論に起因するバイアスや情報の損失を見積もることにした。培養細胞は生体に存在する組織と異なり、豊富な細胞外基質によって支持されているわけではないため、ペレットをそのまま包埋してミクロトームで切削しても切片にはならない（柔らかい細胞の塊としてかきとられるだけである）。また、ペレットを培養液などに懸濁して液体窒素などで凍らせてから包埋切削しても、細胞を含む氷塊は切片にならない（ブレードが氷塊を滑り、削り取ることが出来ない）。このため、細胞を適切な包埋剤の中に懸濁し、これを凍らせて切片を作出する必要がある。ところが、市販の包埋剤に細胞を懸濁したところ、個々の細胞の形態に著明な変化が生じ、そのような変化を遂げた細胞を（凍結することなくそのまま）採取してcDNA増幅すると遺伝子発現に大きなバラツキが認められた。これは包埋剤に懸濁したことによって細胞死が惹起されたことによると考えられる。試行錯誤の結果、細胞の遺伝子発現に全く影響を与えず、市販の包埋剤とほぼ同等の様態で切片を切削可能な包埋剤を同定した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

切片からの単一細胞遺伝子発現解析手法の開発に必要なコントロール実験系を完成しつつあるため。またレーザーマイクロダイセクションシステムを導入し、コントロール系を使った単一細胞の切り出しと、切り出した単一細胞に対するcDNA増幅系を動かして、正確なcDNA増幅を行うための条件検討を進めているため。

Strategy for Future Research Activity

ひきつづき、本実験系を用いてcDNA増幅の条件検討を進める。環境に由来するRNaseを除外するために滅菌、除染を徹底するのみならず、切片作出からレーザーマイクロダイセクションまでの作業動線を最小化する実験環境を整える。