2019 Fiscal Year Annual Research Report
Species and functions of rare actinomycetes in the post-Koch ecosystem
| Project Area | Post-Koch Ecology: The next-era microbial ecology that elucidates the super-terrestrial organism system |
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| Project/Area Number |
19H05685
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
大西 康夫 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 教授 (90292789)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
松本 厚子 北里大学, 感染制御科学府, 准教授 (20300759)
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| Project Period (FY) |
2019-06-28 – 2024-03-31
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| Keywords | 希少放線菌 / 菌株単離 / 二次代謝 / 生合成酵素 / 形態分化 / Actinoplanes / 胞子嚢 / 遺伝子発現制御 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
(1) モデル圃場を含む分離源からの希少放線菌の分離
従来法に工夫を加えた分離法として、(i)リゾチーム添加、(ii)抗生物質前処理、(iii)土壌細菌との共培養を行い、(i)では79株、(ii)では294株、(iii)では7株の希少放線菌を分離した。このうち、モデル圃場からの分離株は48株であり、全分離株のうち、新規性が高いと考えられる株は8株であった。一方、マイクロ培養アレイシステム（900ウェル）を用いた分離に取り組んだが、菌の生育の判別およびウェルからの釣菌が困難であることや1-2週間の培養の間、極小のウェルの乾燥を防ぐことが難しいことがわかり、よりウェルサイズの大きなアレイを使用することの必要性が示された。
(2) 希少放線菌の新たな生理機能の解明
希少放線菌の二次代謝に関する研究においては、Streptacidiphilus griseoplanusおよびKitasatospora azaticaが生産するトリペプチドalazopeptinの全生合成機構の解明に成功し、論文発表した。本研究は、アミノ酸配列上では機能が予測できなかった２つの酵素（リシン5位水酸化酵素、アミノ基に亜硝酸由来の窒素原子を付加してジアゾ基を合成する酵素）の機能を明らかにした点、α/βヒドラダーゼファミリー酵素によるキャリアタンパク質を介したジペチド合成反応を明らかにした点で重要である。一方、モデル希少放線菌Actinoplanes missouriensisの研究においては、胞子嚢の形成・開裂時の遺伝子発現時に必須な機能を有する3つのシグマ因子（FliA1-3）に関する研究成果を論文発表した。さらに、FliA標的遺伝子のうち、特に重要な機能をもつと推定される遺伝子の機能解析を行った。胞子嚢形成への関与が示唆された遺伝子が複数あったが、詳細な解析により、その可能性が否定された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
マイクロ培養アレイシステムはまだ機能していないが、従来法に工夫を加えた分離法によって、合計380株の希少放線菌を分離し、新規性が高いと考えられる株も8株得られた。一方、希少放線菌の二次代謝生合成研究では、以前からの研究の継続ではあるが、新規な反応を触媒する酵素を複数含むalazopeptinの生合成経路の全貌を解明することができた。また、モデル希少放線菌の研究においても、以前からの研究の継続であるが、胞子嚢の形成・開裂時の遺伝子発現時に必須な機能を有する3つのシグマ因子に関する研究を論文発表できた。胞子嚢マトリクスや胞子嚢壁の新規生体成分の同定に関する研究は難航しているものの、全体としておおむね順調に進展していると自己評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
2020年度の報告書に記載した通り、マイクロ培養アレイシステムは196ウェルのものを使用し、寒天中に土壌希釈液を混ぜ込んで培養する混釈法を採用する工夫によって菌株の分離が可能になったが、96穴マイクロプレートを用いた実験より操作性が劣った。なお、96穴マイクロプレートを用いた場合、他の菌株と物理的に隔てた培養によって生育が遅い株を単離できることが示された。今後、マイクロ培養アレイの利用は、底のない196ウェルアレイを用いて共培養システムを開発していくことに重点をおく。一方、2020年度にゲノム配列解析に供した5株については、ゲノムマイニングおよび様々な培養条件でのPCスクリーニングを行い、新規生合成遺伝子クラスターの解析を行うことで、機能未知遺伝子の機能解明に繋げる。一方、モデル希少放線菌に関しては、胞子嚢マトリクス多糖の構造決定、その生合成酵素の機能解明、胞子嚢壁のトリアシルグリセロールの合成と分解に関与する酵素の同定と機能解析に重点をおきつつ、ダイナミックな形態分化の分子機構に関する研究を行う。一方、遊走子からの発芽というプロセスに着目して新たな研究を開始する。具体的には、発芽時において特異的に転写される遺伝子の機能解析を遺伝子破壊により行う。
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