2021 Fiscal Year Annual Research Report
Novel function of the post-Koch ecosystem found only on microbial consortia
| Project Area | Post-Koch Ecology: The next-era microbial ecology that elucidates the super-terrestrial organism system |
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| Project/Area Number |
19H05686
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
野尻 秀昭 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 教授 (90272468)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
新谷 政己 静岡大学, 工学部, 准教授 (20572647)
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| Project Period (FY) |
2019-06-28 – 2024-03-31
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| Keywords | 微生物間相互作用 / 複合系 / 環境汚染物質 / 分解菌 / プラスミド / 接合伝達 / ドロップレット / ラマン散乱 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
疎水性化合物分解に関わる相互作用については、昨年度までに油中水型（ｗ/o）マイクロドロップレットを利用した多環芳香族炭化水素（PAH）分解菌群取得方法を確立していたが、さらにA01-1班と共同でマイクロウェルアレイを利用したPAH分解菌群取得法の開発も完了した。これら開発済の2つの方法を利用して、筑波大学のモデル圃場等に由来するPAH分解菌集積培養液から分解菌群を多数取得することに成功した。それらのPAH分解力と16S rRNA遺伝子の多様性から、分解力が強い時はBurkholderia科が優占する一方で、分解力が弱い場合はMicrococcaceae科が多数になる場合が多いといった「分解力」と「含まれる菌種」間での相関や共存する「マイナー菌種の存在」の影響などを考察できた。また、顕微鏡とフローサイトメトリー（FCM）を用いた固相基質分解菌群の獲得方法を確立し、高分子量PAH分解菌群の分解能に影響を与える菌株のスクリーニングを開始した。
遺伝情報の水平伝播については、以前に複数の環境試料から収集・配列決定したプラスミドの接合伝達性を評価した。その結果、既知の広宿主域型IncP群とは異なり、配列的にはIncP群であるものの狭宿主域型を示すことが明らかになった。また、得られていたプラスミドのうち主にPromA群プラスミドの自然界における本来の宿主を知るために、w/oマイクロドロップレット、デジタルPCR、ソーターを利用した宿主細胞の検出を行った。その結果、宿主候補を500以上の種類の細菌から11種類にまで絞り込むことに成功した。また、プラスミドの塩基配列と伝播先の微生物の全塩基配列（107株）との比較から、塩基組成の類似度が高確度な宿主域予測に重要であることも示された。さらにモデル植物根圏のうち、無施肥の条件からより多くのプラスミドが得られることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
PAH分解ポテンシャルを構成する細菌群とその内部での相互作用を検出する目的で実施していたPAH分解菌群の取得方法の確立は、本年までにほぼ終了した。残るw/oマイクロドロップレット技術の嫌気性ベンゼン分解菌群への応用については、令和4年度には終了できる見通しである。本年度までに、w/oマイクロドロップレット技術とマイクロウェルアレイ技術を用いてPAH分解菌群を多数単離し相互作用を検出することに成功しており、複数の試料からより大規模な検出を同様に実施中である。また、FCMによる人工菌群の作成と顕微鏡による基質定量を鍵技術とした新規PAH分解菌群内での相互作用検出も令和3年度から本格的に開始している。このように、PAH分解に資する細菌間相互作用の検出はほぼ想定どおりに進捗していると判断できる。
一方、モデル圃場内で機能微生物群がどのように形成されたのかを知るために、当該微生物群形成の鍵を握る新規性の高いプラスミドを収集し全塩基配列の解読・性状比較を行った。並行して、得られたプラスミドの環境中における元の宿主を明らかにするポストコッホ技術を公募班との共同研究でほぼ確立した。さらに、プラスミドの接合伝達先の細菌の種類の予測のための指標としてプラスミドと宿主染色体の塩基組成の類似度を導入し、接合伝達実験の結果との照合を行った。今までの解析で良好な結果が得られており、現在、宿主域を左右する因子の同定も並行して進めている。また、プラスミド取得後の遺伝子の安定的な保持のために機能する機構の解明についても、想定どおり進捗しており令和4年も不安定化に影響する因子の同定と影響を及ぼすメカニズムの解明を進める計画である。
高等生物との相互作用については、プラスミド動態に対する植物の影響や、藻類と細菌の相互作用について解析（準備）を進めており、順調に進捗している。
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| Strategy for Future Research Activity |
モデル圃場の環境試料内の微生物が持つ潜在的なPAH分解機能は多数の微生物間相互作用が関与する複雑なものである可能性が高い。これを網羅するように解析するには、土壌から抽出した直後の微生物群やそれを当該基質で適度に集積した様々な微生物群集（PAH分解菌の集積度合いが異なる）を用いて、相互作用の検出と解析を並列に行う必要がある。令和4年度以降は、令和3年度から実施している大規模解析を継続し、得られたデータをマージすることで、土壌細菌を採取した試料内の機能発現のための相互作用を網羅的に検出することを目指す。
プラスミドの環境動態に関しては、令和3年度まで実施してきた研究を継続し、得られている重要なプラスミドについてモデル複合微生物系（全塩基配列既知の細菌で構成）内でどの微生物間へと移動するのかを網羅的に明らかにする。また、細菌ゲノムとプラスミドの塩基配列類似性から宿主域を高確度に予測する手法については、改良を継続する。並行して、w/oマイクロドロップレット、マイクロ流路やデジタルPCR技術を利用して、機能微生物群の構築に重要な遺伝子や，可動性遺伝因子を保有する個々の微生物の同定を行うための技術開発を継続する。さらに接合伝達後の細胞内での外来遺伝子の保持に関わるメカニズムについても解析を継続する。以上の情報を総合することで，モデル圃場内の複合微生物系内における機能微生物群がどのように構築されるのかを，遺伝情報の交換の観点から明らかにする。
また、無施肥のモデル圃場からプラスミドが得られやすい理由について、A02-3と連携して明らかにする。さらに、高等生物と微生物の相互作用へのポストコッホ技術の応用として、微生物間相互作用検出用に開発したw/oマイクロドロップレット技術を、機能性藻類と相互作用する微生物のスクリーニングに応用する。
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