2021 Fiscal Year Annual Research Report
Selective autophagy-mediated cellular regulations
| Project Area | Multimode autophagy: Diverse pathways and selectivity |
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| Project/Area Number |
19H05706
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| Research Institution | Juntendo University |
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Principal Investigator |
小松 雅明 順天堂大学, 大学院医学研究科, 教授 (90356254)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
和栗 聡 福島県立医科大学, 医学部, 教授 (30244908)
杉浦 悠毅 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 講師 (30590202)
李 賢哲 順天堂大学, 医学部, 助教 (30758321)
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| Project Period (FY) |
2019-06-28 – 2024-03-31
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| Keywords | オートファジー / 選択的オートファジー / p62 / 液―液相分離 / KEAP1 / ユビキチン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
1. 選択的オートファジー基質の網羅的探索
オートファジー選択的基質p62液滴・ゲルの精製方法を確立し、精製p62液滴・ゲルの質量分析より複数の選択的オートファジー基質候補群を同定した。さらに、選択的オートファジー阻害マウスの相対定量プロテオミクス分析より選択的オートファジー基質候補の絞り込みを行った。
2. 新規オートファジー分解基質の解析
1.より同定したタンパク質群の中で、実際にp62液滴・ゲルに局在する超分子複合体Xを見出した。オートファジーの薬理学的および遺伝学的阻害によりこの超分子複合体Xが蓄積することを確認した。さらに、超分子複合体X のp62液滴・ゲル局在化及びオートファジー分解は、選択的オートファジーレセプタータンパク質NBR1依存的であることを見出した。1.より同定したタンパク質群の中で、実際にp62液滴・ゲルに局在する代謝酵素Yを見出した。
3. 選択的オートファジーの制御機構
オートファジーの対象となるミスフォールドや変性したタンパク質は、ユビキチン化されp62と結合、液―液相分離（LLPS）によって液滴となる。この液滴は、さらに分解性のタンパク質ゲルへと相転移し、オートファジーにより分解される。しかし、p62のLLPSやゲル状への相転移の制御機構についてはほとんど知られていない。今回、p62のLLPSを制御するキナーゼとしてZを同定した。Zはユビキチンとの結合に必須なp62の403番目のセリン残基をリン酸化し、LLPSを促進した。その一方、ZがKEAP1との結合を増強させる349番目のセリン残基をリン酸化した場合にはLLPSを阻害した。後者のリン酸化はp62が液滴となった後に起こることから、p62液滴の349番目のセリン残基が高度にリン酸化されKEAP1が強固に結合し場合、LLPSが解除されることがわかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
世界初の選択的オートファジー特異的阻害マウスの作製、そして革新的p62液滴・ゲル精製方法の確立、それら開発ツール・メソッドによる新規オートファジー基質群の同定を行った。今後、新規基質の詳細な解析により新しい選択的オートファジーの生理機能の知見が得られることが期待される。
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| Strategy for Future Research Activity |
（１）新規選択的オートファジー基質群の解析
新規に見出したオートファジー選択的基質欠失培養細胞やマウス組織を用いてRNA-seq、メタボロミクス、リピドミクス解析を行う。また、変動した遺伝子や代謝物から異常な代謝経路が見られる表現型を予測し、実際の解析を通して各種選択的オートファジーが担う生理的意義の解明を目指す。メタボロミクス、リピドミクス解析は研究分担者の杉浦、李が担当する。
（２）選択的オートファジーの分子制御
siRNAライブラリーを用いたスクリーニングにより、p62のLLPSを制御するホスファターゼとしてWを同定した。Wはユビキチンとの結合に必須なp62の403番目のセリン残基を脱リン酸化し、LLPSを解除した。ホスファターゼWのLLPS制御機構やそれに連動するユビキチン化タンパク質分解における意義を検証する。また、p62の349番目のセリン残基あるいは403番目のセリン残基のリン酸化を指標としたsiRNAライブラリーを用いたスクリーニングにより新規LLPSあるいはユビキチン化タンパク質分解の制御因子の検索を行う。
（３）選択的オートファジー阻害マウスの開発と解析
国外共同研究者であるJin-A Lee博士（韓南大学）は、オートファゴソームに局在し選択的オートファジーに寄与するAtg8ファミリータンパク質に結合する人工プローブHyD-LIR(TP)を開発した（EMBO J, 2017）。このプローブを過剰発現させることで、オートファゴソーム形成には影響を与えず、選択的マクロオートファジーを各臓器で阻害できるマウスを開発した（Nat Comm 2021）。このマウスを利用し、全身性、各組織（少なくとも、肝臓、脳）における選択的オートファジーの生理的意義を評価する。
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