2019 Fiscal Year Annual Research Report
DNAメチル化とH3K9me3の確立と維持の構造基盤
| Project Area | Mechanisms underlying replication of non-genomic codes that mediate plasticity and robustness for cellular inheritance |
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| Project/Area Number |
19H05741
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| Research Institution | Yokohama City University |
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Principal Investigator |
有田 恭平 横浜市立大学, 生命医科学研究科, 准教授 (40549648)
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| Project Period (FY) |
2019-06-28 – 2024-03-31
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| Keywords | 構造生物学 / DNAメチル化 / DNA複製 / ユビキチン化 / ヒストン修飾 / クライオ電子顕微鏡 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
非ゲノム情報であるDNAメチル化やヒストン修飾は、細胞の遺伝子発現パターンを規定し細胞形質を決定する。細胞が一度獲得した非ゲノム情報は個体の生涯を通して維持される。これにより哺乳類の多細胞形質は維持される。本研究では、遺伝子発現抑制的な非ゲノム情報であるDNAメチル化とH3K9me3の確立と維持機構に着目し、構造生物学的な研究を行う。
【項目1】DNAメチル化維持はDNAメチル化酵素DNMT1とそのリクルーターであるUHRF1が必須である。複製直後に起こる維持メチル化では、UHRF1は複製因子PAF15をユビキチン化し、これがDNMT1を複製サイトに呼び込む働きをする。この複製と連携した維持メチル化機構の解明のために今年度はPCNA：ユビキチン化PAF15：DNAの3者複合体のクライオ電子顕微鏡による構造解析に取り組んだ。
【項目2】ヒストンH3K9メチル化酵素SETDB1はレトロトランスポゾンや組織特異的な遺伝子の発現抑制に寄与する。SETDB1のヒストンメチル化活性はユビキチン化により制御されるが、その活性化の分子機構は不明である。また、SETDB1のユビキチン化はE3酵素非依存的に起こるが、その分子機構も不明である。ユビキチン化によるSETDB1の活性化機構を構造生物的な観点から解明するために、大腸菌内共発現系を構築して、大腸菌内の出の効率的なユビキチン化SETDB1の調製を試みた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
【項目1】均一にユビキチン化されたPAF15を調製するために、PAF15のユビキチン化されるリジン残基をシステイン残基に置換して、G76Cユビキチンとジスルフィド結合で連結させたユビキチン化PAF15アナログを調製した（PAF15-Ub2）。Native Gel Shift Assay でPCNAとDNAの結合は見られなかったが、PAF15またはPAF15-Ub2を加えるとPCNAがDNAに結合した。PCNA:PAF15-Ub2:DNAの3者複合体をクライオ電子顕微鏡で観察した。その結果、DNAの末端でPCNAが留まっている粒子像を再構成できた。しかし、PAF15やユビキチンに相当する電顕マップは観測できず、PAF15-Ub2がPCNAをDNAに係留させる機構はわからなかった。
同じ電顕観察像からPCNAとPAF15の複合体構造を4.1Å分解能で解析できた。PCNAの分子量は9万弱だが、PCNAの特徴的なリング構造が電顕画像からの粒子の抽出に有利に働いたと考えられた。次年度以降、DNMT1を加えた4者複合体のクライオ電顕による構造解析を目指すが、PCNAの構造的特徴は粒子の判別に有利に働くと考えられる。
【項目2】ユビキチン化に必要なE1, E2, ユビキチン遺伝子をpCDFDuetプラスミドにコードした大腸菌内ユビキチン化ベクターをデザインした。pGEX6P-1プラスミドに全長SETDB1、またはヒストンメチル化に関与するSETドメインをクローニングしてユビキチン化ベクターと大腸菌内で共発現させた。大腸菌培養後に発現チェックを行い、CBB染色の結果、ユビキチン化プラスミドと共発現でSETDB1より高分子量側にバンドが観測された。抗ユビキチン抗体を用いたウエスタンブロッティングで、SETDB1は大腸菌内ユビキチン化ベクターでユビキチン化されることがわかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
【項目1】複製と連携したDNA維持メチル化の解明のために、PCNA:PAF15-Ub2:DNAの3者複合体にDNMT1を加えて、クライオ電顕による構造解析を目指す。DNMT1をDNA上に留めて、複合体のコンフォメーションの均一化のためにDNAの長さや配列のデザインを行う。4者複合体の形成をGel Shift Assayや分析ゲルろ過カラムクロマトグラフィーで評価する。クライオ電顕観察のためのグリッド作製の条件や、複合体安定化のためのクロスリンク実験を行い、構造解析を目指す。
【項目2】大腸菌ユビキチン化システムの最適化を行い、より高効率にSETDB1をユビキチン化できる条件を探索する。ユビキチン化SETDB1を高純度に精製できる条件の確立を目指し、構造解析に適した純度のタンパク質の調製を行う。
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