2020 Fiscal Year Annual Research Report
ヒストン修飾Eraserによる抑制的エピゲノムの維持・変動制御機構の解明
| Project Area | Mechanisms underlying replication of non-genomic codes that mediate plasticity and robustness for cellular inheritance |
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| Project/Area Number |
19H05742
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
村上 洋太 北海道大学, 理学研究院, 教授 (20260622)
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2019-06-28 – 2024-03-31
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| Keywords | ヘテロクロマチン / RNAi / Epe1 / JmjCタンパク質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では優れたモデル生物である分裂酵母を用いてヒストンH3 Lys9 (H3K9me) で規定されるヘテロクロマチンの複製、維持、制御機構の解明をめざす。我々はH3K9meの脱メチル化ドメインJmjCドメインをもつEpe1は、異所的なH3K9meを除去するEraserとして機能する一方で、(1)ユークロマチンに散在する潜在的ヘテロクロマチン形成部位でのヘテロクロマチン形成をJmjCドメイン非依存的に抑制する(2)恒常的ヘテロクロマチンでRNAi機構をG2期に活性化し複製により減少したH3K9meを補填すること明らかにした。これらの知見はEpe1が抑制的クロマチン構造複製・変動制御のマスターレギュレーターであることを示している。本年度は以下の点を明らかにした。
1) 前年度、「散在するプロモーター」がEpe1のRNAi依存ヘテロクロマチン形成に重要なシグナルになっている可能性がでてきた。この点を確認するために、転写ユニットのリピートをゲノムに挿入し、RNAi依存的ヘテロクロマチンターゲットになり得るか検討をおこなった。ade6遺伝子6コピー挿入した時に強力なヘテロクロマチンが形成され、RNAi依存的に安定に依存されることを見いだした。
2) Epe1は主にRNAiに依存したヘテロクロマチン維持に機能する。一方、RNAiはヘテロクロマチンの新規形成にも機能することがわかっているがそのメカニズムは不明であった。Tgs1は転写されたsnRNAやsnoRNAのCap構造をメチル化しTrimethyl guanosine capを作る良く保存された酵素であが、Tgs1がRNAiによる新規ヘテロクロマチン形成時に、複数の経路を介して機能することを明らかにした。
3) マウスのJmjCタンパク質23種についてCRISPR-Cas9を用いたKO細胞を作成した。本年度は18種についてKO候補株を作製している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
新型コロナウイルスによる活動自粛により、実験をおこなう時間が制限を受けたため、全体に予定より進行は遅れている。
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| Strategy for Future Research Activity |
1) 昨年度発見したリピート配列特異的RNAi依存ヘテロクロマチン形成にEpe1が関与するか検討する。この系は複雑な転写パターンをもとのヘテロクロマチン領域配列と異なりシンプルな転写ユニットで形成されて居るため、Epe1がこの系に関与する場合、その分子メカニズム、Epe1による転写活性化とRNAiの関連の解析が容易になることが期待される。また、このようなシステムがほ乳類細胞で機能するか、リピート配列をマウス細胞ゲノムに挿入して解析を進める。
2) 昨年度予定してていたEpe1のリン酸化部位の決定とその機能解析をおこなう。タグを付加したEpe1発言株を作製し、タグを用いたEpe1精製をおこない、質量分析によりリン酸化されるアミノ酸を決定する。Epe1は分解を受けやすく、かなりのタンパク質が不溶性画分に存在するため、変性条件化で細胞破砕をおこなうことで、分解を防ぐとともに可溶化を試みる。リン酸化されるアミノ酸が決定できればリン酸化できないアミノ酸置換およびリン酸化類似のアミノ酸置換を導入した株を作成し、Epe1機能への影響を検討する。
3) 哺乳類でのEpe1ホモログの探索：昨年度作成したKO細胞を用いてヘテロクロマチンの変化を系統的に検討する。
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