2021 Fiscal Year Annual Research Report
ヒストン修飾Eraserによる抑制的エピゲノムの維持・変動制御機構の解明
| Project Area | Mechanisms underlying replication of non-genomic codes that mediate plasticity and robustness for cellular inheritance |
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| Project/Area Number |
19H05742
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
村上 洋太 北海道大学, 理学研究院, 教授 (20260622)
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| Project Period (FY) |
2019-06-28 – 2024-03-31
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| Keywords | ヘテロクロマチン / 分裂公募 / RNAi / 反復配列 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では優れたモデル生物である分裂酵母を用いてヒストンH3 Lys9 (H3K9me)で規定されるヘテロクロマチンの複製、維持、制御機構の解明をめざす。分裂酵母の恒常的ヘテロクロマチンは基本的にRNAi機構により確立・維持されている。ヒストン脱メチル化酵素の触媒ドメインJmjCドメインをもつEpe1は、異所的なH3K9meを除去することが知られている。一方、昨年度我々はEpe1 がRNAi機構を恒常的ヘテロクロマチンでG2期に活性化し、複製により減少したH3K9meを補填すること明らかにした。これらの知見はEpe1が抑制的クロマチン構造複製・変動制御のマスターレギュレーターであることを示している。さらに昨年度は、 Epe1がRNAi機構を活性化する際、恒常的ヘテロクロマチンに散在するプロモーターからの転写を活性化することを明らかにし「散在するプロモーター」とEpe1の組合せが効率良いRNAi依存ヘテロクロマチン形成のシグナルになっている可能性を示した。本年度は通常遺伝子の反復した配列をユークロマチンに挿入し、その遺伝子に対応するsiRNAを人為的に供給すると反復配列上でRNAi依存ヘテロクロマチン形成が誘起され、その後人為的siRNA供給なしに自律的なRNAi依存ヘテロクロマチン形成が安定に維持されることを示した。この自律的RNAiの確立にはEpe1が必須であった。一方単一コピーの転写ユニット上に形成されたヘテロクロマチンではEpe1はヘテロクロマチン除去をおこなう。これらの結果から転写ユニットの反復がEpe1によるRNAi活性化の鍵となることが明確に示された。多くの生物種で反復配列がヘテロクロマチン化されることが知られていたが、そのメカニズムは未知であった。我々の発見はこのメカニズムの一端を示したもので、ヘテロクロマチン形成の根本の理解に大きく貢献するものである。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Epe1が単一コピーの転写ユニットではH3K9meを除去するが、反復する転写ユニットでは自律的なRNAi機構を誘起しH3K9meを維持するという、新規の知見を得た。これは、多くの生物でみられる反復配列でのヘテロクロマチン形成という普遍的現象でありながら機構が未知の現象に解答をあたえるもので、重要な発見である。
また、本研究で使用した反復配列によるヘテロクロマチン誘起のシステムは、シンプルな転写ユニットに基づく系であるため、RNAiによるヘテロクロマチンの分子機構を解析する上で強力なツールになることが期待できる。
一方昨年度計画していたEpe1のリン酸化機能制御の解析はリン酸化部位決定に十分の量のEpe1を回収できず、精製方法の最適化を試みており、順調とはいえない。
また哺乳類でのEpe1ホモログ探索については、jmjCドメイン蛋白質18種について遺伝子破壊をおこない表現型解析をおこなったが、ホモログに相当する表現型を示すものは得られていない。
全体としては、おおむね順調に進んでいると判断する。
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| Strategy for Future Research Activity |
1) Epe1のヘテロクロマチン維持に必要なドメインの決定：上記の反復配列による自律的RNAi依存ヘテロクロマチン形成系を用いることで、ヘテロクロマチン維持のステップを独立してassayできる。この系をもちいて、各種Epe1変異体を作成して、ヘテロクロマチン維持に必要なドメインを同定し、その機能を詳細に調べる。
2) スプライシング因子のヘテロクロマチン形成での役割：分裂酵母ではスプライシング因子がヘテロクロマチン形成に寄与する事が示されているが、その分子機構・生理的意義は明らかではない。反復配列による自律的RNAi依存ヘテロクロマチン形成系はヘテロクロマチン確立と維持を分けて解析ができるため、スプライシングが確立、維持どちらに関わるかを明らかにし、その過程での機能を詳細に検討する。
3) リン酸化によるEpe1の制御：引き続き質量分析によりEpe1のリン酸化部位を決定するために、Epe1の可溶化、精製方法の改良をおこなう。
4) 哺乳類でのEpe1ホモログの探索：残り5つのJmjC蛋白質についてCRISPR-Cas9による遺伝子破壊をおこない、Epe1と同様の機能を持つ蛋白質の探索をおこなう。箕面から無かった場合、方針を変えて、マウス細胞に分裂酵母と同様に反復した転写ユニットを導入し、その挙動の解析を始める準備をおこなう。
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