2021 Fiscal Year Annual Research Report
Understanding of non-genome replication during hematopoietic cell differentiation
| Project Area | Mechanisms underlying replication of non-genomic codes that mediate plasticity and robustness for cellular inheritance |
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| Project/Area Number |
19H05747
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
谷内 一郎 国立研究開発法人理化学研究所, 生命医科学研究センター, チームリーダー (20284573)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
河本 宏 京都大学, ウイルス・再生医科学研究所, 教授 (00343228)
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| Project Period (FY) |
2019-06-28 – 2024-03-31
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| Keywords | 非ゲノム情報 / T細胞 / エピジェネティクス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞分裂を超えた細胞形質の継承過程ではゲノム情報の正確な複製に加え、DNAメチル化やヒストン翻訳後修飾などの化学修飾性コード、高次クロマチン構造、非コードRNAを含めた非ゲノム情報の継承が必須である。一方でこのような非ゲノム情報は可塑性を有し、それ故に書き換えによる細胞形質の改変が可能であり、多細胞生物に於いて同じゲノム情報を持ちながら多様な細胞種を生み出す基本原理として機能する。即ち、状況に応じた非ゲノム情報の改変と精密な複製を制御する分子機構の解明は医学・生物学の重要な課題である。本研究課題では、血球系細胞分化を研究対象におき、細胞形質の継承と改変を制御する非ゲノム情報複製機構を解明することを目的とした研究計画を構築した。2021年度はCrispr/Cas9を用いた網羅的な分子機能喪失系を構築し、Cd8遺伝子の発現維持を指標にしたgRNAライブラリーのスクリーニングを実施し、Cd8遺伝子発現維持に必須の分子を少なくとも5種類同定した。それらにはCd8発現に関与する事が知られているDot1LやRunx3が含まれていたことから、スクリーニングは機能していると考えられた。またT細胞からのPax5の脱抑制的発現を指標にしたスクリーニングを行う為にPax5遺伝子座にDsRed蛍光タンパク質を挿入したレポーターTgマウスを樹立した。
同時に高次クロマチン構造の形成と維持に関わる核タンパクの同定とその機能解析を実施する為の新たな研究手法としてE3ユビキチンライゲースとの結合を誘導する低分子化合物を利用した薬剤依存的一過性タンパク質分解系を構築した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Cd8遺伝子の発現維持を指標にしたgRNAライブラリーのスクリーニングを実施した。Cas9Tgマウス由来のCD8T細胞にレトロウイルスgRNAライブラリーを導入し、CD8の発現が優位に低下した細胞を分離し、対称群に比し濃縮されたgRNAを同定するためにNGS解析を行った。その結果、約30種類の候補分子を得た。これら候補分子に対し個別のgRNAを導入し２次スクリーニングを行なった結果、Cd8遺伝子発現維持に必須の分子として少なくとも5種類の分子を同定した。これら分子には既にCd8発現に関与する事が知られているDot1LやRunx3が含まれていた。次にこれら分子の作用機序を解明する目的で、候補分子の機能欠損によるCD8発現低下に対するHDAC阻害剤、DNAメチル化阻害剤の効果を検討した。
Pax5の発現誘導をT細胞からB細胞への細胞形質転換の指標とする目的で、Pax5遺伝子発現をDsRed蛍光タンパク質の発現で可視化するレポーターアレルを持つ遺伝子改変マウスを樹立した。具体的にはCRISPR/Cas9によるゲノム切断を利用し相同組み換え効率を増強することでPax5遺伝子の3’UTR領域にires-DsRed配列を挿入した。
またThpok遺伝子座を中心とした高次クロマチン構造形成に必須のBcl11b転写因子、Satb1タンパク質の薬剤誘導的に一過性に分解する系を構築する目的で領域内共同研究を行い、オーキシンデグロン(AID)に必要なタグ配列をBcl11b、Satb1に挿入したマウスを作製した。またAID系のE3ユビキチンライゲースであるOsTIR1を発現するTgマウスを樹立した。交配により目的の遺伝子型を有するマウスを作製し、オーキシン投与によりマウス生体内でBcl11b、Satb1の一過性分解が起こる事を確認した。
この様に計画した研究は概ね順調に進んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後も非ゲノム情報の複製に関与する分子の同定とその機能解明を目的とした研究を行う。Cd8遺伝子発現維持に関与する分子は単独での機能欠損のみならず、複数の分子の複合欠損による効果を検定する。またPax5-DsRedレポーターマウスをCas9 TgマウスとのダブルTgマウスを作製し、gRNAライブラリーのスクリーニングを実施する。
またBcl11b、Satb1の薬剤誘導的一過性分解系を利用し、これら分子が高次クロマチン構造の維持に必要か明らかにする。具体的には薬剤投与後のタンパク質分解前後で、Thpok遺伝子座を起点とした高次クロマチン構造をHi-C/4-Cにより測定する。またBcl11b、Satb1と会合する分子の網羅的同定を目的に、マウス生体内で近位依存性ビオチン標識法(BioID法)を実施できる様にBioID酵素を内在性タンパク質に付与したTgマウスを作製し、これら分子の生理的な会合分子を同定する。
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[Journal Article] A variant in human AIOLOS impairs adaptive immunity by interfering with IKAROS2021
Author(s)
Yamashita Motoi、Kuehn Hye Sun、Okuyama Kazuki、Okada Satoshi、Inoue Yuzaburo、Takagi Masatoshi、Kanegane Hirokazu、Takeuchi Masahiro、Shimojo Naoki、Tsumura Miyuki、Padhi Aditya K.、Zhang Kam Y. J.、Boisson Bertrand、Casanova Jean-Laurent、Ohara Osamu、Rosenzweig Sergio D.、Taniuchi Ichiro、Morio Tomohiro
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Journal Title
Nature Immunology
Volume: 22
Pages: 893～903
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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