2019 Fiscal Year Annual Research Report

Reconstitution of totipotent nuclei in a test tube

Planned Research

Project Area	Program of totipotency: From decoding to designing
Project/Area Number	19H05755
Research Institution	Institute of Physical and Chemical Research
Principal Investigator	新冨圭史国立研究開発法人理化学研究所, 開拓研究本部, 専任研究員 (60462694)
Project Period (FY)	2019-06-28 – 2024-03-31
Keywords	染色体 / 再構成 / 再プログラム化
Outline of Annual Research Achievements	マウスで核移植クローン作出する際には、ドナー核を分裂期のレシピエント胚に顕微注入する必要があり、間期のレシピエント胚を用いてもうまく発生が進まない。この重要な経験則は、ドナー核を分裂期染色体へと変化させることがクローン作出に必須な準備段階であることを示している。これまでの予備実験から、ドナー核のモデルとしてカエル赤血球核を単離し、分裂期に停止した卵抽出液に加えたところ、核膜崩壊と染色体構築を再現できた。さらに、その後に細胞周期を間期に進めると、核が再形成されDNA複製が検出された。一方で、赤血球核をいきなり間期核に加えても複製が検出されなかった。上記の結果から、核移植胚でドナー核が複製能力を回復するまでの素反応を再現する実験系が確立できたと言える。そこで、今年度はに、この過程をさらに詳細に理解することを目的として、可能な限り少ない種類の精製タンパク質を使って赤血球核-染色体変換を再構成する準備を進めた。まず、実験材料の調製法を検討した。具体的には、染色体構築に不可欠なコンデンシンI（5つのサブユニットからなるタンパク質複合体）とトポII、また、その前段階にある核膜崩壊を誘起するキナーゼCDK（サイクリンBとCdk１の複合体）の組換えタンパク質をデザインし、バキュロウイルスー昆虫細胞をホストとして発現した。さらに、多段階のクロマトグラフィーによって、いずれも高い純度の精製標品を得ることに成功した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason ここに述べた精製タンパク質表品の調製は、再構成実験の律速段階である。コロナ禍のために活動時間が制限された中でも、事前にプロトコルの詳細を検討するなど周到な準備行った上で計画に着手した。新たに本研究計画に参画したテクニカルスタッフが効率的かつ迅速に作業を進めた甲斐もあり、大きな滞りなく目標を達成することができた。一般に昆虫細胞をホストとしてタンパク質複合体の発現させることは困難だと言われていたが、単一ウイルスベクターに複数のcDNAを導入する新しい方法を導入することによって、この技術的難点を克服できた点も大きな収穫だったと言える。
Strategy for Future Research Activity	核移植による体細胞クローン作出の際に起こる核の再プログラム化の分子メカニズムを理解するために、「赤血球核と可能な限り少ない種類の精製タンパク質を使って染色体を再構成する」ことに挑戦する。すでにリコンビナントタンパク質（コンデンシンI、トポII、CDK）の調製で良好な結果を得ているので、これらの精製標品と赤血球核をインキュベーションして、核膜崩壊と染色体を再構成できる条件を検討する。順調に進めば、実際のマウスの核移植実験でドナー核として使用される卵丘細胞や血液細胞（単球や顆粒球）についても同様の再構成を試し、さらに、領域内での共同研究を通じて、タンパク質処理後の核を除核卵に移植した際にクローン作出効率を向上できるかを検討する。