2021 Fiscal Year Annual Research Report
Regulation of physiological renal functions via dynamic cellular transports of biometals
| Project Area | Integrated Biometal Science: Research to Explore Dynamics of Metals in Cellular System |
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19H05770
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| Research Institution | Tokushima Bunri University |
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Principal Investigator |
藤代 瞳 徳島文理大学, 薬学部, 講師 (10389182)
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| Project Period (FY) |
2019-06-28 – 2024-03-31
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| Keywords | 有害金属 / 生命金属 / 腎障害 / 近位尿細管 / カドミウム / シスプラチン / 元素イメージング / 組織内分布 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
私たちは、有害金属（Cd）や金属（Pt）含有薬物が引き起こす腎障害機構と有害金属による生命金属動態の攪乱作用の解明を目指している。
イタイイタイ病のようなCd腎症を完全に再現することはできなくても、近位尿細管における再吸収障害のモデルとして、Cd-MT投与モデル検討した。短期間でCd-MT複合体を投与し、元素イメージングによるCdの分布、および腎障害に関する指標の経時変化を解析した結果、腎臓におけるCd分布は、Cd-MT投与後3～8時間では、Cdは皮質の辺縁部から皮質全体に分布していたが、18時間から3日後では髄質に近いS3領域が豊富な領域にも分布した。今後この実験モデルを用いてCdによる腎障害の特徴であるファンコニー症候群発現メカニズムを解析するため、リン、Ca再吸収障害発症機構を明らかにしていきたい。
CDDPによる腎障害には活性酸素（ROS）の産生が関与していることが報告されている。そこで、S1, S2, S3細胞間での酸化ストレスに対する応答について比較検討した。CDDPおよびROSを産生するパラコート曝露により、24時間後の細胞内ROS量がS1, S2細胞に比べてS3細胞で顕著に高かった。S3細胞のCDDP高感受性にROS産生が関与することが示唆されたため、S1, S2, S3細胞にCDDPを曝露して、抗酸化システムを担うタンパク質発現量を調べた。コントロールレベルのこれらのタンパク質の発現量は、S3細胞で特に発現量が低くなかった。一方、チオレドキシン、チオレドキシン還元酵素、γ-グルタミルシステイン合成酵素、ヘムオキシゲナーゼの発現量が、S3細胞においてのみCDDP曝露により減少していた。よって、S3細胞がCDDPに対して高い感受性を示す原因の１つとしてCDDPによるROS消去能の低下が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Cdによる腎障害機構を解明するために、in vivoおよびin vitro系の両方を活用し検討を行ってきた。昨年度までに、マウスへのCd-metallothionein（Cd-MT）複合体モデルを用いて、投与後1-3時間では皮質側に分布し、その後8-18時間経過すると皮質と髄質の境界領域へと分布することを明らかにした。これらの結果を、CDDPおよびPt含有薬物投与マウスの腎臓におけるPtの分布についても応用可能である。Laser Ablation-ICP-MSによる元素イメージングにより毒性の発現と金属局在との関係を明らかにする系を確立しつつある。
一方、これまでに腎臓近位尿細管由来不死化細胞を用い、in vitroでの低分子量タンパク質（β2-MG, MT）の再吸収効率および金属輸送を解析する系を樹立した。その系を活用して、CdCl2曝露による近位尿細管再吸収効率が低下や、ミトコンドリア機能タンパク質の発現変化を見いだした。今後は、CdCl2による再吸収効率低下のメカニズムを明らかにする。CDDPについてはROSおよび抗酸化システムの関与が示唆されたため、さらに詳細な変化について培養細胞と動物を用いて検討する。また、様々な腎障害誘発金属の細胞内鉄濃度への影響も明らかにしたい。
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| Strategy for Future Research Activity |
元素イメージングを活用した有害金属の局在については、またin vivo だけでなく、in vitroでのこれらの細胞内局在をまた、Cd, CDDP, ウランの細胞内局在については、Spring8を用いて、査型顕微分光計測装置での細胞内局在の検討を行う（研究協力者松川、B01-1小椋、B01-4武田との連携研究）。また、腎障害誘発金属（CDDPやウラン）が近位尿細管の特にS3領域を障害するが、その機構はわかっていない。CDDPの腎障害にROSの関与が報告されているため、CDDP曝露による抗酸化システムの変化を調べた結果、TrxとTxnrdの発現低下が関与している可能性を見出した。そこで、有害金属による近位尿細管障害のメカニズムを明らかにするため、Cdによるミトコンドリア機能障害については、生理学研究所にて、Cd投与マウスの腎臓におけるミトコンドリア形態異常が起こっているか電子顕微鏡で解析し、CDDPについても解析し、比較検討する（第1期公募A01西田との連携研究）。
これまでにA03-1神戸との連携研究により、腎臓におけるCd, Mn輸送体ZIP8の役割を検討してきた。近年、多くの疾患とZIP8をコードするSLC39A8のSNP（rs13107325）との関連が次々と報告され、その変異のMn輸送への影響や金属結合モチーフについて解析し、ZIP8のTransmembrane domain5のE-H motifがMn、Cdの輸送活性を与えている可能性を見出した。今後、様々な変異による金属輸送およびZIP8の構造変化を解析し（第1期公募B01重田との連携研究）、腎臓におけるZIP8によるMn恒常性の調節機構を明らかにしたい。
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