2020 Fiscal Year Annual Research Report
Time-resolved XFEL crystallography and rational engineering of light-driven proteins
| Project Area | Non-equilibrium-state molecular movies and their applications |
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| Project/Area Number |
19H05777
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
岩田 想 京都大学, 医学研究科, 教授 (60452330)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
野村 紀通 京都大学, 医学研究科, 准教授 (10314246)
近藤 美欧 大阪大学, 工学研究科, 准教授 (20619168)
山下 恵太郎 東京大学, 大学院理学系研究科(理学部), 客員共同研究員 (20721690) [Withdrawn]
草木迫 司 東京大学, 大学院理学系研究科(理学部), 助教 (80815316)
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| Project Period (FY) |
2019-06-28 – 2024-03-31
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| Keywords | 膜タンパク質 / 光遺伝学 / X線自由電子レーザー / 時分割X線結晶構造解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
(1)植物由来の光動作タンパク質CRY2はクロモフォアとしてFADを有し、青色光照射により異性化を起こす。培養細胞内のシグネル伝達を人為的に操作する光遺伝学ツールとしても多用されているが、二光子励起顕微鏡により生体内の深部組織の細胞をピンポイントで活性化する技術はこれまでに無かった。既報のCRY1の静止立体構造に基づき内部フレキシブルループに青色蛍光タンパク質TagBFP2を挿入する人工タンパク質の分子設計を行い、TagBFPからのFRETによりCRY2の構造異性化を誘起するというコンセプトに基づく新規な２光子励起光遺伝学ツールを創出した（Kinjo et al., Nat. Methods, 2019）。
(2)チャネルロドプシン（ChR）は光駆動型カチオンチャネルである。ChRは7本の膜貫通ヘリックス（TM1～7）を有し、クロモフォアとして全トランス型レチナール（ATR）を有し、特定波長の励起光を吸収すると異性化を起こし、その異性化に伴い構造変化が引き起こされる過程の高速分子動画撮像に成功した。SFX時分割構造解析に適した微結晶の作製条件を最適化後、X線自由電子レーザー施設SACLAにてSFX時分割構造計測を行い、励起光照射後50μs, 1 ms後の構造変化を2.8Å分解能で得た。異性化したATRによるアミノ酸残基、さらにそれに伴うヘリックスの構造変化によりChRは基底状態から開状態に遷移することが明らかになった。光動作タンパク質のSFX時分割構造解析の技術基盤が確立できた（Oda et al., eLife, 2021）。
(3)光動作性金属錯体触媒RuPの時間分割XAFS解析を行い、RuPが犠牲還元剤によって消光する過程が追跡できた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
(1)立体構造情報に基づく光動作タンパク質のエンジニアリングにより、新規の光遺伝学ツール2paCRY2を創出し、この成果は国際的にも評価が高い学術誌であるNature Methods誌にて発表できたため、本年度の目標は概ね達成できている。
(2)TR-SFXのモデル系として光応答性膜イオンチャネル（チャネルロドプシン）C1C2を対象として時分割構造計測を行い、レチナールの光異性化反応に伴うタンパク質分子骨格の動作原理が解明できた。この成果は国際的にも評価が高い学術誌であるeLife誌にて発表できたため、本年度の目標は概ね達成できている。
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| Strategy for Future Research Activity |
（１）光動作タンパク質のSFX時分割構造解析：これまでに培ったSFX時分割構造解析の基盤技術と経験を活用し、各種の光動作タンパク質を対象としてSFX時分割構造計測を進める。とくに本研究課題で創出された２光子励起型の光遺伝学ツール2paCRY2のSFX時分割構造解析を行い、分子設計の合理性を検証するとともに、さらなる高機能化に向けての改善方針を見出す。B01南後班、C01 久保班との連携のもとに研究を進める。
（２）光で機能制御が可能な人工タンパク質の合理的創出とSFX時分割構造解析：生体内の大部分のタンパク質は光動作性ではないので、（１）で記した方法はごく一部のタンパク質にしか適用できないことになる。この弱点を補完するために、元来、天然では光動作性を示さないGPCR等のタンパク質を、光で異性化するフォトクロミック分子を用いて人工的に光動作タンパク質に変換し、SFX時分割構造解析を行う。B01清中班と連携して、光異性化するアゾベンゼン修飾リガンドで構造変化を惹起できる化学遺伝学的なGPCR活性制御法を開発し、時分割結晶構造解析を行う。
（３）光で反応制御が可能な小分子のSFX時分割構造解析：新学術分野開拓の意欲的な試みとして、光応答性金属錯体触媒―抗体複合体化による人工機能性分子の創出と時分割構造解析を実施する。金属錯体触媒が関わる反応の高速分子動画の撮影と反応に伴って生成する各種中間体の原子分解能での構造を同定することで反応機構の詳細を解明する。低分子金属触媒フレームワーク化とその触媒反応の時分割構造解析を試みる。B01南後班との連携のもとに研究を進める。
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[Journal Article] Structural insights into tetraspanin CD9 function2020
Author(s)
Umeda Rie、Satouh Yuhkoh、Takemoto Mizuki、Nakada-Nakura Yoshiko、Liu Kehong、Yokoyama Takeshi、Shirouzu Mikako、Iwata So、Nomura Norimichi、Sato Ken、Ikawa Masahito、Nishizawa Tomohiro、Nureki Osamu
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Journal Title
Nature Communications
Volume: 11
Pages: 1606
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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