Structural analysis of various light-driven reaction mechanisms of light-sensitive proteins.

2019 Fiscal Year Annual Research Report

• Project Area: Non-equilibrium-state molecular movies and their applications
• Project/Area Number: 19H05779
• Research Institution: Yokohama City University
• Principal Investigator: 朴 三用 横浜市立大学, 生命医科学研究科, 教授 (20291932)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 梅名 泰史 岡山大学, 異分野基礎科学研究所, 特別契約職員(准教授) (10468267)
• Project Period (FY): 2019-06-28 – 2024-03-31
• Keywords: cGMP光産生酵素 / 光反応酵素 / X線自由電子レーザー

Outline of Annual Research Achievements

光によって感応・応答するタンパク質には、動物や植物などに広く分布する発色団を含み、生命維持に関与するなど重要な役割を果たすものが知られる。近年では、こうした光感受性タンパク質を利用して、細胞などの光操作する技術に応用され、これまでに多くの生理現象の解明に利用されてきた。中でも、光遺伝学は、細胞や組織の生理機能を明らかにするための非常に強力な研究手法であると同時に、疾病の治療への応用の観点からも注目されている。本研究では解明されたOaPAC光活性化メカニズムの構造科学的解明を基に、細胞内でのセカンドメッセンジャー光制御への光遺伝学の展開や、PACの酵素ドメイン改変によるcGMP光産生酵素の創出、更には脳病変発生などにおける発生学的疾病の機構解明と治療を光制御医学ツールとして基礎医学的研究を目指す。
本年度ではOaPACに対して微結晶調製に適した結晶化条件を検討し、放射光X線を使った回折実験から結晶性能を確認することを試みた。微小結晶を用いた実験系としては、各タンパク質事に、様々な実験条件の調整が必要となることが想定されるので、それらを解決する必要があった。光感受性アデニル酸シクラーゼ(OaPAC)については単結晶から得られた静的な構造がすでに明らかであったので、まずこの結晶化条件を微小結晶調製用に改良することを試みた。しかしながらもともと結晶化自体の再現性はある程度高いものの、回折能のある結晶出現の頻度が低く、その歩留まりは10%程度であった。今後、更に結晶化の最適化を進めて行く予定である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究班では、様々な発色団を含んだタンパク質をターゲットとし、XFEL(X線自由電子レーザー) を利用した高速分子動画法により、光感受性タンパク質の多様な光応答機構の解明を目指している。藍藻（ランソウ）由来の光感受性アデニル酸シクラーゼ(OaPAC)は、細胞内セカンドメッセンジャーcAMP, cGMP分子合成における青色光による制御を可能にする酵素である。OaPACに対して微結晶調製に適した結晶化条件を検討し、放射光X線を 使った回折実験から結晶性能を確認することを試みた。OaPAC結晶化の再現性はある程度高いものの、回折能のある結晶出現の頻度が低く、その歩留まりは10%程度であった。これらの条件検討を行った結果、0.1M-クエン酸ナトリウム pH5.0, 10%(w/v) PEG20K条件で、良質な結晶が得られ、この結晶化条件と、シード結晶を用いて、微結晶作製を行った。様々な条件化で、微結晶の大きさは平均30ミクロンの結晶を得た。今後、これらの微結晶の結晶性確認を行う予定である。

Strategy for Future Research Activity

PACは日本の研究グループによって発見されたタンパク質で、青光により活性化アデニル酸シクラーゼcAMP分子を量産する酵素として、特性解明や生物機能光制御への展開も提唱・実行してきた（Nature, 2002）。本申請者は、PACの相同遺伝子であるOaPACの立体構造解明に世界初めて成功し、光活性化機構に関する構造科学的な研究は本研究グループが先駆的に積み上げてきた。神経興奮の光制御、いわゆる「光遺伝学、optogenetics」が急速に普及し、OaPACによるcAMPを介する生体機能光制御も概念上同類とみなされつつあるが、はるかに広範で多彩な生命活動の光制御につながり、血管新生・脳病変原生・神経回路ネットワーキング・記憶などの光発生医学現象の制御・解明・治療・創薬スクリーニングという広大な新分野の開拓を先導するものであり、かつ独創的な新領域の研究分野であると言える。このような目標に向け、今後、OaPACタンパク質をターゲットとし、XFEL(X線自由電子レーザー) を利用した高速分子動画法により、光感受性タンパク質の多様な光応答機構の解明を目指している。

Research Products

• [Journal Article] Non-cryogenic structure of a chloride pump provides crucial clues to temperature-dependent channel transport efficiency. (2019)
  • Author(s): un JH, Li X, Park JH, Wang Y, Ohki M, Jin Z, Lee W, Park SY, Hu H, Li C, Zatsepin N, Hunter MS, Sierra RG, Koralek J, Yoon CH, Cho HS, Weierstall U, Tang L, Liu H, Lee W.
  • Journal Title: J Biol Chem. Volume: 294 Pages: 794-804
  • DOI: 10.1074/jbc.RA118.004038
  • Peer Reviewed