2019 Fiscal Year Annual Research Report
酵素が巧みに織りなす化学反応過程のダイナミズムの撮像
| Project Area | Non-equilibrium-state molecular movies and their applications |
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| Project/Area Number |
19H05780
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| Research Institution | Tottori University |
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Principal Investigator |
永野 真吾 鳥取大学, 工学研究科, 教授 (60286440)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
溝端 栄一 大阪大学, 工学研究科, 講師 (90571183)
中津 亨 京都大学, 薬学研究科, 准教授 (50293949)
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| Project Period (FY) |
2019-06-28 – 2024-03-31
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| Keywords | 酵素反応 / XFEL / 結晶構造解析 / 微結晶 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
永野酵素班では，代表者の永野がディールスアルダー反応を行う酵素，分担者の溝端が炭素固定鍵酵素Rubisco，中津が発光タンパク質イクオリンの高速分子動画の撮影を目指して研究を進めている。本年度は，試料調製を中心に研究を進め，それぞれの研究実績の概要は以下の通り。
ディールスアルダー反応を行う酵素Phm7の結晶構造を決定し，ドッキングシミュレーションなどの理論計算により基質が結合する部位を推定した。また，試験管内でディールスアルダー反応の活性測定系を確立し，推定される基質結合部位のアミノ酸の置換によって活性が大きく減少することなどを確認した。このことからドッキングシミュレーションで推定された部位に基質が結合すると考えられ，この酵素によるディールスアルダー反応のメカニズムの一端を明らかにしつつあり，今後の高速分子動画の撮影の重要なデータを得ることができた。
Rubiscoについては，微結晶の調製方法を確立することができた。次に，精製試料を用いた微結晶の作製条件，および，得られた微結晶がSFX計測の際に安定に保持されるバッファーの条件を確立した。SACLAにてノーマルSFXにより回折データを収集し，分解能1.9オングストロームで結晶構造を決定することに成功し，今後の高速分子動画の撮影に期待が持たれる。
また，発光タンパク質であるイクオリンの大量発現系の構築および，SACLA実験に向けた新規結晶化条件の探索を行い，数十ミリグラムのイクオリンを生産できる発現系を確立し，1.4オングストローム分解能で構造決定することができた。これらの結果は高速分子動画の撮影の準備が整いつつあることを示している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究ではディールスアルダー反応を行う酵素Phm7，炭素固定化酵素Rubisco,そして発光タンパク質イクオリンをターゲットとしているが，すべての酵素について結晶構造が決定されており，Rubiscoについては微結晶を用いたSFXによる結晶構造解析も完了するなど，高速分子動画撮影の準備が進みつつある。また，Phm7では，基質の安定性が低いため非常に困難と思われていた試験管内活性測定系を確立し，ディールスアルダー反応の制御機構を明らかにするために重要な評価を行うことが可能となった。イクオリンについて，従来は塩である硫酸アンモニウムを沈殿剤として結晶化を行っていたが，SFX実験の際，塩が析出し測定に支障が生じる課題があった。そこで，塩とは異なり高分子のPEG400を用いた新たな条件で結晶が得られ，SPring-8のBL41XUでX線回折実験を行い，1.4オングストローム分解能での立体構造決定に成功した。さらに水素の位置を観測するための大型結晶，SACLA実験に向けた微結晶もできており，今年度の実験を行うための準備も順調にできている。
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| Strategy for Future Research Activity |
ディールスアルダー反応を行う酵素については微結晶の調製をすすめ，BL41XUビームラインを利用したSS-ROXによる結晶の質の評価を行う。また，温度ジャンプ法による酵素反応の同期的な開始をめざし準備を進める。
また，Rubisocoについては時分割SFXにより分子動画を撮影するための条件検討を進める。微結晶中での酵素反応速度を明らかにし，反応開始後，どのタイミングでXFELを照射して構造のスナップショットを撮影するかを見積もる。また，反応の同期的制御に必要なケージド基質濃度やレーザー照射の効率を最適化する。
イクオリンについては，発光メカニズムの全容解明に必要な水素の位置の決定を目指し1.0オングストローム分解能を超える構造解析を実施する。また微結晶を用いてBL41XUにおけるSS-ROX実験を行うことにより，SACLA実験に適した質，サイズの結晶が得られる条件を探索する。また，最適化された条件で得られる結晶から収集した回折データからX線のダメージを受けやすいイクオリンの過酸化状態の構造を確認する。その後，SFX実験を実施する。イクオリンはカルシウムイオンの結合に伴う構造変化により発光がスタートすると考えられている。そこで，溶液中におけるカルシウムイオンの結合について速度論的解析を行う。
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