2020 Fiscal Year Annual Research Report
酵素が巧みに織りなす化学反応過程のダイナミズムの撮像
| Project Area | Non-equilibrium-state molecular movies and their applications |
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19H05780
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| Research Institution | Tottori University |
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Principal Investigator |
永野 真吾 鳥取大学, 工学研究科, 教授 (60286440)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
中津 亨 京都大学, 薬学研究科, 准教授 (50293949)
溝端 栄一 大阪大学, 工学研究科, 講師 (90571183)
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| Project Period (FY) |
2019-06-28 – 2024-03-31
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| Keywords | X線自由電子レーザー / 分子動画 / 酵素 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
基質非結合型の微結晶を用いた構造決定を目指したが、Phm7と Fsa2いずれにおいても良質な微結晶を得ることが困難であった。そこで、すでに大型単結晶を用いて決定している基質非結合型の結晶構造を用いて基質結合型酵素の分子動力学（MD）シミュレーションなどを行った。その結果、Phm7とFsa2の活性部位ポケット内で、それぞれの基質のコンフォメーションは互いに疑似的な鏡像の関係にあることが明らかとなり、これらの結合モデルが立体選択的なディールスアルダー反応を説明できることを示した(Fujiyama and Kato et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2021)。
非ヘム鉄及び2オキソグルタル酸依存性のタウリン水酸化酵素の金属非結合型微結晶を作製し，静的SFXにより構造決定した。その結果，活性部位に金属イオンが存在しないことが確認された。2液混合SFXにより，この微結晶と鉄イオンを酸素存在下で混合することで今後この酵素の分子動画撮影が期待できる。
イクオリンの微結晶作成条件を確立し、SACLAでのSFX実験により、1.55A分解能での構造解析に成功した。これまで課題であった過酸化部位について、X線損傷を受けていない状態で構造を決定することができ、反応過程追跡のためのスタートとなる正確な立体構造を高分解能で解析することができた。
2020年度は、活性型リガンドフリーRubiscoの微結晶を調製し、SPring-8およびSACLAにて1.9オングストローム分解能で構造解析することに成功した。また、非活性型リガンドフリーRubiscoの微結晶を作製し、SPring-8にて2.2オングストローム分解能で構造解析することができた。跡のためのスタートとなる正確な立体構造を高分解能で解析することができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ディールスアルダー反応を立体選択的に行う2種類の酵素の微結晶を用いた基質非結合型の構造決定に至っていないものの，MDシミュレーションや量子化学計算，および生化学的な解析を駆使することで，酵素への基質結合様式と立体選択的なディールスアルダー反応を可能とするメカニズムを明らかとすることができた。
イクオリンについてはSFX実験を実施するための微結晶作成条件の最適化を行い、結晶の大きさをコントロールできるようになった。SFX実験を実施するための増粘剤として、グリースとセルロースが適していることがわかり、長辺が30umの結晶では1.55オングストローム分解能、5umの結晶では1.7オングストローム分解能のX線回折強度データを収集した。構造解析を行った結果、これまでの解析ではX線損傷により明らかとなっていなかった過酸化部位の構造が明らかとなり、SACLAによる時分割測定の初期構造を得ることに成功した。
Rubiscoのリガンドフリー結晶構造を決定することは一般に困難であると知られていたが、今回、結晶化条件を工夫することで、その課題を解決することができた。これにより、SACLAでの分子動画撮影に向けた道筋を開くことができ、順調な進捗にあるといえる。
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| Strategy for Future Research Activity |
ディールスアルダー反応を行う酵素の高速分子動画撮影に向けて、これまでとは異なる条件で空間群が揃った良質な微結晶を作製する必要がある。そこで，分子表面に存在するループ領域を欠損させた変異体などを作成し，良質な微結晶の作成を進める。また，非ヘム鉄及び2オキソグルタル酸依存性のタウリン水酸化酵素の，金属非結合型微結晶に鉄イオンを再結合させる実験を進め，この酵素の高速分子動画撮影の準備を進める。
イクオリンについてはカルシウム結合に伴う発光過程の分光学的解析を行うことにより、2液混合SFX実験の時間スケールを決定し、SACLAでの２液混合実験を実施する。またカルシウムで反応を進行させた結晶を液体窒素につけることにより、低温トラップする。すなわち異なる反応時間で反応を止めた結晶を複数作成し、それぞれの結晶をSPring-8でX線回折強度データを収集し構造決定することにより、構造変化の過程を追跡する。
Rubiscoの触媒反応は５段階の部分から構成されるマルチステップな反応とみることができる。非活性型リガンドフリー結晶構造が得られたことで、そこから活性型酵素に変化する過程の分子動画の撮影につなげることができる。また、活性型リガンドフリーRubiscoの結晶構造を解析できたことから、今後、基質RuBPを添加することで、基質がエノール化される過程の動的構造の解明が期待できる。一方、CO2またはO2の付加反応の分子動画の撮影を目指し、新たに活性型-基質複合体Rubiscoの結晶を作製する予定である。
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[Journal Article] Molecular basis for two stereoselective Diels-Alderases that produce decalin skeletons2021
Author(s)
Keisuke Fujiyama, Naoki Kato*, Suyong Re, Kiyomi Kinugasa, Kohei Watanabe, Ryo Takita, Toshihiko Nogawa, Tomoya Hino, Hiroyuki Osada, Yuji Sugita, Shunji Takahashi*, Shingo Nagano*
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Journal Title
Angew. Chem. Int. Ed.
Volume: 60
Pages: 22401-22410
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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