2021 Fiscal Year Annual Research Report
Development of fixed target micro-crystallography dedicated to structural dynamics study
| Project Area | Non-equilibrium-state molecular movies and their applications |
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| Project/Area Number |
19H05783
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
山本 雅貴 国立研究開発法人理化学研究所, 放射光科学研究センター, 部門長 (60241254)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
熊坂 崇 公益財団法人高輝度光科学研究センター, 構造生物学推進室, 室長 (30291066)
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| Project Period (FY) |
2019-06-28 – 2024-03-31
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| Keywords | X線結晶構造解析 / 構造ダイナミクス / 放射光 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
真空カメラおよびin-situ測定系についてさらなる装置の高度化を進めた。
真空カメラ：寄生散乱等によるバックグラウンド散乱を低減するための入射光学系の改良を進めた。具体的には、据付調整に多くの時間が必要で、また調整軸が少ない等の理由から集光レンズの使用をやめ、常に状態が把握されており、また集光手順が確立したビームライン常設KB集光ミラーに入射光学系を切り替えた。また、バックグラウンド散乱の原因となる寄生散乱除去のため四象限スリットの導入と条件検討を進め、バックグラウンド散乱の一層の低減が可能になった。一方で、大気圧下の光学調整のみでは、減圧環境でなければ検出できない低レベルの非対称バックグラウンド散乱が残ることが明らかとなった。試料グリッド調製では、凍結時の温度制御条件を検討し、結晶固定に不可欠な水薄膜をアモルファス氷として再現性よく凍結できる条件を確立した。
In-situ測定用試料雰囲気制御の開発を主として行った。試料環境雰囲気制御に用いる試料環境(pH/温度/湿度)制御装置の高温対応について、湿度制御の安定により70°Cまでの実験が可能となり、リゾチーム結晶の高温測定から水和状態の観察と評価を進めた。微小結晶に対応したSS-ROX法によるタイムスライス高速データ測定法の開発では、HAG法の測定自動化とレーザー/測定系同期回折測定システムを構築、SS-ROX法の実験機会を提供した。HAG法に適した結晶化方法開発では、4量体形成ペプチド断片をタンパク質のN/C両末端に接続し、単量体や会合体での会合度や安定性を評価しつつ、新規に3種類のペプチド会合体を見出した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
真空回折計の開発では、2021年度に予定した入射光学系の改良および試料調製法の検討を計画通り完了した。入射光学系の改良では、集光系をレンズからミラーへ変更し、より精緻な光学調整と高強度X線の利用を可能にした。また、寄生散乱除去のためのスリットの導入やピンホールサイズの検討などを行いバックグラウンド散乱の低減に成功した。試料調製法では、試料グリッド凍結時の温度制御条件の検討を行い、氷結晶の出ない凍結条件を確立した。これらの改良により、前年度よりもさらにバックグラウンド散乱を低減させた。またこの検討の中で一層の高度化に寄与する次年度の検討課題を発見したことが、順調に進展したとする理由である。
in-situ測定系の設計製作では、調温調湿装置を恒温動物の体温を含む高温側に拡張する開発を行っている。pH調整湿潤ガスの調製で利用実績のある蒸気圧の高い過熱水蒸気方式を採用した湿潤ガス製造装置と新たに導入したサーキュレータの組み合わせ、試料吹き付けノズルの断熱・保温機構を改良し、窓材付近の結露への対策により20-70℃における調湿操作を可能とした。微小結晶に対応したSS-ROX法によるタイムスライス高速データ測定法の開発では、自動化に向け、HAG法を用いて凍結保存した試料を試料交換ロボットで入れ替えるための整備を進めた。また、OPOレーザーをゴニオメーター上の試料に照射するための光学系を構築した。結晶化法は、設計した逆並行コイルドコイルヘテロ4量体形成ペプチドタグを目的蛋白質のN/C両末端に接続し、２種類の混合により会合体形成が可能になったが、一部で混合前にホモ会合体形成がみられるため改良を進めている。また設計基盤となる新たな4量体ペプチド2組の結晶構造も得た。いずれも進捗がみられており、順調に推移している。
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| Strategy for Future Research Activity |
2021年度に行った実験で明らかになった改善点の検討を行い、装置、測定法を一層高度化する。真空回折計の開発では、より微小な結晶試料からのデータ測定、構造解析に資する高S/N比回折像の取得に向けた開発を継続する。バックグラウンド散乱の異方性解消に向け、入射光学系の検討や調整方法の確立を目指す。また、試料ホルダについては、より効率的なデータ収集のためのSiN窓大型化に向け、窓のサイズや膜厚について検討を進める。
高温対応調温調湿装置については放射光ビームラインへの設置および動作試験を実施、この装置の試験測定と安定化の為の改良を行いつつ、20－70℃昇温測定法の開発を進める。rtHAG法とSS-ROX法を組み合わせた微小結晶の室温測定法のユーザー利用をすすめるとともに、SACLAで実績のある高粘度媒体インジェクターを用いたシリアル測定法の整備を進める。これらの実験環境は、領域内研究者を中心に実験機会の提供を進めていく。また、HAG法に適した結晶化法の開発では3-6量体会合体の創出に加え、実際の蛋白質に付加したときの効果の評価も並行して行う。
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[Presentation] タンパク質結晶回折ビームラインの現状と今後2021
Author(s)
長谷川和也, 馬場清喜, 水野伸宏, 奥村英夫, 河村高志, 村上博則, 仲村勇樹, 増永拓也,小倉章衣, Marcel Bokhove, 堀坂恵美, 石原知子, 八木直人, 熊坂崇
Organizer
SPring-8シンポジウム
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