時間分解構造解析を補完する精密顕微分光計測

2021 Fiscal Year Annual Research Report

• Project Area: Non-equilibrium-state molecular movies and their applications
• Project/Area Number: 19H05784
• Research Institution: University of Hyogo
• Principal Investigator: 久保 稔 兵庫県立大学, 理学研究科, 教授 (90392878)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 木村 哲就 神戸大学, 理学研究科, 准教授 (70506906) ; 古谷 祐詞 名古屋工業大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (80432285)
• Project Period (FY): 2019-06-28 – 2024-03-31
• Keywords: 時間分解X線結晶構造解析 / 時間分解紫外可視吸収分光 / 時間分解赤外分光 / 時間分解ラマン分光 / 時間分解蛍光分光 / 動的構造生物学

Outline of Annual Research Achievements

本新学術領域の目標の一つは、時間分解結晶構造解析（分子動画）を軸としたタンパク質のダイナミクス研究を他分野と複合的に融合させて、タンパク質を設計・制御・操作する新しい学問領域を形成することである。そこで本研究では、分子動画と時間分解分光法（紫外可視吸収分光、ラマン・赤外分光、蛍光分光）との相関的・補完的解析を推進し、分子動画と他手法との融合の先鞭をつける。
本研究では溶液測定に加えて、タンパク質微結晶を測定できる顕微測定技術を開発し、分子動画との相補解析を強く推進することを課題としてきたが、本年度に至り上記すべての分光法について顕微技術開発を完了した。従って今後は、新規ロドプシン、ヘム酵素、DNAフォトリアーゼ、発光タンパク質等、分子動画研究の対象試料の分光計測に注力する。いずれも光や金属を巧みに利用するタンパク質であり、動的機能原理に興味が持たれる。
本年度の分光研究の大きな成果としては、(1)塩化物イオンポンプロドプシンNM-R3、及び(2)N2O発生酵素P450norの中間体の顕微分光解析であり、それぞれの系において分子動画との相関解析を行ない、動的メカニズムを解明した。特に(2)の研究では、中間体がラジカル種であることを赤外分光で明らかにし、メカニズムの物理化学が解明された。その他、ヘリオロドプシンやイクオリンについても、開発した顕微技術を用いた分光解析に成功しており、分子動画との相関研究を進めている。ヘリオロドプシンについては、赤外分光法により初期中間体におけるレチナール周辺の微細な水素結合変化が明らかにされた。DNAフォトリアーゼについては、2種の酵素の時間分解分光研究を進め、生物種により反応ダイナミクスが大きく異なることが見えてきた。それらフォトリアーゼの中間体構造の解明が次のステップである。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

各種顕微分光技術の開発を一通り終え、さらにそれらを用いた時間分解分光研究を構造解析と共に論文発表することができた為。

Strategy for Future Research Activity

開発した分光技術を活用して時間分解分光研究をさらに推し進める。特にヘリオロドプシン、イクオリン、DNAフォトリアーゼの中間体解析に力を入れていく。また、新学術領域公募班のもつ新たな試料も研究対象としながら、新学術領域が生み出す分子動画の精密解析を大きく展開する。

Research Products

• [Journal Article] Conformational alterations in unidirectional ion transport of a light-driven chloride pump revealed using X-ray free electron lasers. (2022)
  • Author(s): Hosaka, T. et al.
  • Journal Title: Proc. Natl. Acad. Sci. USA Volume: 119 Pages: e2117433119
  • DOI: 10.1073/pnas.2117433119
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] A synthetic model for the possible FeIV2(μ-O)2 core of methane monooxygenase intermediate Q derived from a structurally characterized FeIIIFeIV(μ-O)2 complex. (2022)
  • Author(s): Mikata, Y., Aono, Y., Yamamoto, C., Nakayama, H., Matsumoto, A., Kotegawa, F., Harada, M., Katano, H., Kobayashi, Y., Yanagisawa, S., Kubo, M., Kajiwara, A., Kodera, M.
  • Journal Title: Inorg. Chem. Volume: 61 Pages: 786-790
  • DOI: 10.1021/acs.inorgchem.1c02699
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Revisiting alkane hydroxylation with m-CPBA (m-chloroperbenzoic acid) catalyzed by nickel(II) complexes. (2021)
  • Author(s): Shinke, T., Itoh, M., Wada, T., Morimoto, Y., Yanagisawa, S., Sugimoto, H., Kubo, M., Itoh S.
  • Journal Title: Chem. Eur. J. Volume: 27 Pages: 14730-14737
  • DOI: 10.1002/chem.202102532
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Short-lived intermediate in N2O generation by P450 NO reductase captured by time-resolved IR spectroscopy and XFEL crystallography. (2021)
  • Author(s): Nomura, T., Kimura, T., Kanematsu, Y., Yamada, D., Yamashita, K., Hirata, K., Ueno, G., Murakami, H., Hisano, T., Yamagiwa, R., Takeda, H., Gopalasingam, C., Kousaka, R., Yanagisawa, S., Shoji, O., Kumasaka, T., Yamamoto, M., Takano, Y., Sugimoto, H., Tosha, T., Kubo, M., Shiro, Y.
  • Journal Title: Proc. Natl. Acad. Sci. USA Volume: 118 Pages: e2101481118
  • DOI: 10.1073/pnas.2101481118
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Capturing structural changes of the S1 to S2 transition of photosystem II using time-resolved serial femtosecond crystallography. (2021)
  • Author(s): Li, H., Nakajima, Y., Nomura, T., Sugahara, M., Yonekura, S., Chan, S. K., Nakane, T., Yamane, T., Umena, Y., Suzuki, M., Masuda, T., Motomura, T., Naitow, H., Matsuura, Y., Kimura, T., Tono, K., Owada, S., Joti, Y., Tanaka, R., Nango, E., Akita, F., Kubo, M., Iwata, S., Shen, J.-R., Suga, M.
  • Journal Title: IUCrJ Volume: 8 Pages: 431-443
  • DOI: 10.1107/S2052252521002177
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Inverse Hydrogen-Bonding Change Between the Protonated Retinal Schiff Base and Water Molecules upon Photoisomerization in Heliorhodopsin 48C12 (2021)
  • Author(s): Tomida, S., Kitagawa, S., Kandori, H., Furutani, Y.
  • Journal Title: J. Phys. Chem. B Volume: 125 Pages: 8331-8341
  • DOI: 10.1021/acs.jpcb.1c01907
  • Peer Reviewed
• [Presentation] マイクロ流路デバイスを用いた時間分解顕微分光法による膜輸送の分子機構解析 (2022)
  • Author(s): 木村哲就
  • Organizer: 神戸大学先端融合研究環開拓プロジェクトシンポジウム
  • Invited
• [Presentation] 膜輸送タンパク質 ABC トランスポーターの機能・構造変化の分光学的解析 (2022)
  • Author(s): 木村哲就
  • Organizer: 日本分光学会 関西支部令和３年度講演会
  • Invited
• [Presentation] Time-resolved infrared and XFEL analyses of P450nor reaction intermediates using caged-substrate. (2021)
  • Author(s): Kubo, M.
  • Organizer: Pacifichem2021
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Combining time-resolved XFEL crystallography with IR spectroscopy for capturing P450nor reaction intermediates. (2021)
  • Author(s): Kubo, M.
  • Organizer: Pacifichem2021
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 時間分解赤外分光法を用いた(6-4)光修復酵素の光修復中間体の追跡 (2021)
  • Author(s): 楞野亜衣, 山田大智, 山元淳平, 久保稔
  • Organizer: 第47回生体分子科学討論会（優秀ポスター賞受賞）
• [Presentation] Structure of a heme-oxy intermediate of cytochrome P450BM3 catalyzing a non-natural substrate (2021)
  • Author(s): 桑野わ子, 長尾聡, 當舎武彦, Joshua Kyle Stanfield, 笠井千枝, 有安真也, 荘司長三, 杉本宏, 久保稔
  • Organizer: 第59回日本生物物理学会年会（学生発表賞受賞）
• [Presentation] Infrared Spectroscopy for analyzing chemical reactions and protein functions (2021)
  • Author(s): Furutani, Y.
  • Organizer: Webinar on microscopy & microanalysis: towards high impact research series 5
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 時間分解赤外分光法から見たタンパク質の動的構造変化 (2021)
  • Author(s): 古谷祐詞
  • Organizer: 第94回日本生化学会大会
  • Invited
• [Presentation] Surface-enhanced infrared spectroscopy on heliorhodopsin (2021)
  • Author(s): Furutani, Y.
  • Organizer: Pacifichem2021
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Time-resolved spectroscopic analysis on structural changes during the transportation process of sodium pump rhodopsin KR2 (2021)
  • Author(s): Tomida, S., Wada, A., Kandori, H., Furutani, Y.
  • Organizer: Pacifichem2021
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 時間分解分光法を用いたヘムABCトランスポーターBhuUV-Tにおける輸送過程の速度論的解析 (2021)
  • Author(s): 木村哲就
  • Organizer: 第59回日本生物物理学会年会
  • Invited
• [Presentation] ナノディスク再構成型BhuUV-Tによる段階的な基質輸送の分光学的観察 (2021)
  • Author(s): 木村哲就, 浅田拓也, 林沙英, 鍔木基成, 城宜嗣, 杉本宏
  • Organizer: 第21回日本蛋白質科学会年会
  • Invited
• [Presentation] Developments and applications of time-resolved microspectroscopy for protein micro-crystals (2021)
  • Author(s): Kimura, T.
  • Organizer: Pacifichem2021
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Transmembrane electron-transfer reaction of 101F6 protein reconstituted into nanodisc (2021)
  • Author(s): Yamaguchi, A., Abosharaf, H., Tsubaki, M., Kimura, T.
  • Organizer: Pacifichem2021
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Structural changes of a-synuclein, an intrinsically disordered protein, along the lipid-binding and oligomerization revealed by fluorescence lifetime measurements (2021)
  • Author(s): Sasada, K., Kimura, T., Matsubara, R., Fujii, K.
  • Organizer: Pacifichem2021
  • Int'l Joint Research