2010 Fiscal Year Annual Research Report
非天然アミノ酸の部位特異的導入技術を用いたタンパク質の揺らぎ解析
| Project Area | Molecular Science of Fluctuations toward Biological Functions |
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20107005
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| Research Institution | Japan Advanced Institute of Science and Technology |
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Principal Investigator |
芳坂 貴弘 北陸先端科学技術大学院大学, マテリアルサイエンス研究科, 教授 (30263619)
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| Keywords | タンパク質 / 非天然アミノ酸 / 揺らぎ / 4塩基コドン / 無細胞翻訳系 / マルトース結合タンパク質 / 蛍光共鳴エネルギー移動 / 一分子測定 |
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| Research Abstract |
本研究では、4塩基コドンを用いた非天然アミノ酸のタンパク質への部位特異的導入技術を用いて、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)のドナーとアクセプターとなる2種類の非天然アミノ酸をタンパク質の特定部位へ導入することで、タンパク質の構造揺らぎをFRETを用いて計測することを試みている。また20種類の天然アミノ酸以外に、多種類の非天然アミノ酸のタンパク質への導入系を確立し、非天然アミノ酸置換により揺らぎを制御できるシステムを開発する。そのためにまず、タンパク質のN末端あるいはN末端領域に蛍光標識アミノ酸を効率的に導入する手法を確立して、その手法を用いて、N末端にFRETのドナーとなる蛍光標識アミノ酸を、内部の様々な部位に非蛍光性アクセプターとなる非天然アミノ酸を導入した、マルトース結合タンパク質を合成した。蛍光寿命測定とその解析により、N末端と内部部位の2点間距離およびその揺らぎが測定可能であることが示された。さらに、光安定性の高い2種類の蛍光標識アミノ酸を導入したタンパク質を合成して、二重蛍光標識タンパク質の構造変化に伴うFRET効率の変化を、フロー式1分子蛍光測定により測定できることも実証した。また、アミノ酸置換の揺らぎへの影響を系統的に評価する上で有用となる、1種類のアンバーコドン置換遺伝子から20種類のアミノ酸置換タンパク質を効率的に合成できる手法の開発、および、翻訳後修飾に伴うタンパク質の揺らぎ解析に有用となる、蛍光標識された翻訳後修飾タンパク質の合成法の開発も行なった。
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