2020 Fiscal Year Annual Research Report
細胞内局所パラメトリック翻訳における物理化学的調節機構の解明
| Project Area | Parametric biology based on translation rate regulatory mechanism |
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20H05785
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
原田 慶恵 大阪大学, 蛋白質研究所, 教授 (10202269)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
岡部 弘基 東京大学, 大学院薬学系研究科(薬学部), 助教 (20455398)
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| Project Period (FY) |
2020-10-02 – 2023-03-31
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| Keywords | パラメトリック / 細胞内温度計測 / 細胞内局所加熱 / 翻訳速度 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
遺伝子発現に可変性をもたらす翻訳速度制御の細胞内機構はどのようなものだろうか？これまでに翻訳が障害された際にmRNA上で停滞したリボソームを脱落させる機構が知られているが、昨今の次世代シークエンサーを用いたリボソームプロファイリングの結果から、翻訳異常時だけでなく、定常的にmRNA-リボソーム複合体には種々の状態が存在し、翻訳速度がダイナミックに変動するパラメトリックな翻訳現象が示唆された。このことから、翻訳速度変化は翻訳異常への応答だけでなく、環境適応やストレス応答、神経機能など臨機応変かつ劇的な生命機能を担うと考えられてきた。しかし、細胞内局所において翻訳速度の変動を駆動・制御する機構は分かっていない。この原因は、これまで細胞内で翻訳速度調節を担う物理化学的な要因を解明した研究がほとんどなかったためである。
我々はこれまでに細胞内局所に時空間的な温度変動があることを見出した。翻訳は最大の細胞内エネルギー消費反応であることから、本研究では、翻訳速度に与える物理化学的機構として細胞内温度に着目した。そこで、細胞内局所のパラメトリックな翻訳速度調節の駆動力として細胞内局所での発熱および温度不均一性の関与を検証する。そこで、独自の細胞内局所温度の計測法や局所温度操作法を用いて、翻訳反応の熱収支や翻訳複合体の状態やダイナミクスに与える細胞内温度変動の影響を解析すること、及びその機構の解明を目的とした。
本年度は、本研究で必要となる手法である細胞内局所温度測定法や局所加熱法、細胞内翻訳活性評価法、細胞内mRNA追跡法の構築を行った。さらに、これを用いて細胞内翻訳が発熱反応であることを見出した。今後は翻訳速度と温度変化の関係を詳細に検討するとともに、その機構と意義の解明を目指す。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は蛍光性ポリマー温度センサーによる細胞内温度マッピング法や蛍光ナノダイヤモンドによる細胞内局所温度計測法の改良と応用により、細胞内局所の温度変化を高速かつ高精度に計測する方法を構築した。さらにこの方法を用いて、薬剤等により翻訳活性を変調した細胞内温度測定から翻訳反応の熱特性を検討した。この結果、翻訳阻害剤を処理した細胞内では無処理時と比較して定常的温度が優位に低いこと、さらに分化誘導した細胞において分化依存的な発熱が翻訳依存的であったことから、翻訳反応が発熱反応であることを発見した。
次に、細胞内温度操作時の翻訳活性・速度の変化を検討するため、IRレーザー照射や金修飾蛍光ナノダイヤモンドへの可視レーザー照射により細胞内局所を定量的に加熱する方法を開発した。また、細胞内の翻訳活性を評価する方法として、ピューロマイシンアナログを細胞内の翻訳中のペプチドに取り込ませて蛍光標識する方法を構築した。さらに、細胞内局所でmRNA-リボソーム複合体を一分子レベルで直接観察する方法を開発した。独自のmRNAプローブに光安定性に優れた明滅色素2MeSiRを連結し、細胞内蛍光プローブの光子分布から重心位置を解析することでmRNA1粒子を追跡可能となった。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は翻訳速度と温度変化の関係を詳細に検討するとともに、その機構の解明を目指す。まず、翻訳と細胞内温度の関係について、翻訳阻害剤や適応する細胞種を拡大して詳細に検討する。また、細胞内の定常温度と翻訳活性の関係を直接検討するため、同一細胞の温度と翻訳活性を計測する方法を開発する。次に、IRレーザー照射や金修飾蛍光ナノダイヤモンドへの可視レーザー照射により細胞内局所を定量的に加熱した際の翻訳活性・速度の変化を観察する。翻訳活性の評価には、これまでに開発した細胞内翻訳活性評価法に加えて、リボソームプロファイリング法を用いて詳細な翻訳複合体の状態変化を検討する。さらに、温度シグナリングによる翻訳速度調節を実証するため、特定のmRNAを選択的に加熱してその翻訳活性を操作する技術を開発する。金ナノ粒子の表面修飾によりRNAプローブと連結することで特定mRNAを選択的に金ナノ粒子と結合させる。また、翻訳活性を阻害した細胞や局所加熱を行なった細胞内でmRNAの一分子追跡を行うことにより細胞内温度変化依存的な翻訳調節機構を考察する。
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[Journal Article] Viral RNA recognition by LGP2 and MDA5, and activation of signaling through step-by-step conformational changes2020
Author(s)
Ivana Duic, Hisashi Tadakuma, Yoshie Harada, Ryo Yamaue, Katashi Deguchi, Yuki Suzuki, Shige H Yoshimura, Hiroki Kato, Kunio Takeyasu, Takashi Fujita
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Journal Title
Nucleic Acids Research
Volume: 48
Pages: 11664-11674
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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