2021 Fiscal Year Annual Research Report

pHストレス適応を司るpH誘導型転写因子の実体解明

Planned Research

Project Area	Establishment of pH Biology
Project/Area Number	20H05788
Research Institution	Kyoto University
Principal Investigator	高橋重成京都大学, 工学研究科, 准教授 (70604635)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	圓岡真宏京都大学, 高等研究院, 特定助教 (70736412)
Project Period (FY)	2020-10-02 – 2023-03-31
Keywords	pHストレス適応 / がん / 転写因子
Outline of Annual Research Achievements	本研究ではpHに対する生物学的理解に変革を起こすべく、pH誘導型転写因子の同定という生命科学の最重要課題の一つに挑むことを主たる目的とする。令和二年度までの研究により、腫瘍で特に発現増加が認められるプロトン排出系タンパク質8種類が、低pH刺激により発現増加することをおよそ15種類の肺がん細胞株を使った実験により明らかにしている。即ち、細胞には低pH刺激応答してプロトン排出系タンパク質の発現誘導が行われるシステム（pH誘導型転写因子）の存在が強く示唆された。pH誘導型転写因子の同定は、低pH刺激により特に発現増加が認められた遺伝子のエンハンサー領域に結合するタンパク質を網羅的に探索する戦略と、CRISPR Screeningによって同定する二つの戦略を立てた。当該年度においては、まず低pH刺激による遺伝子発現誘導に必要なエンハンサー領域を同定するべく、CRISPR-Cas9技術を駆使して上流・下流それぞれ約2000bpにおいて各200bpずつ欠損した遺伝子欠損細胞株をA549およびH838細胞にて多数樹立した。加えて、圓岡（研究分担者）においては、低pH刺激により発現増加が認められた遺伝子の上流にGFPを組み込んだノックイン細胞株の樹立することでCRISPR Screeningを行う準備を整えた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 当該年度の研究により、低pH刺激により発現増加が認められた遺伝子の上流・下流それぞれ約2000bpにおいて、CRISPR-Cas9技術およびシングルセルクローニングを行うことで、各200bpずつ欠損した遺伝子欠損細胞株をA549およびH838細胞にて約30種類樹立した。加えて、圓岡（研究分担者）においては、低pH刺激により発現増加が認められた遺伝子の上流にGFPを組み込んだノックイン細胞株を樹立した。これら細胞株を樹立することで、次年度において行うエンハンサー領域の同定およびCRISPR Screening に向けて、万全の準備が整った。
Strategy for Future Research Activity	次年度においては、当該年度において構築した様々な欠損細胞株を用いて、低pH刺激による発現誘導が欠失する細胞株を探索することで、エンハンサー領域を同定する。また、deactivated Cas9 (dCas9)を用いた特定のゲノムDNA領域に結合するタンパク質の網羅的同定方法を確立させる。また、圓岡（研究分担者）においては、GFPを組み込んだノックイン細胞株を用いた、CRISPR Screening を実施する。