2020 Fiscal Year Annual Research Report
Elucidation of pH signals in biological systems
| Project Area | Establishment of pH Biology |
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| Project/Area Number |
20H05791
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
岡村 康司 大阪大学, 医学系研究科, 教授 (80201987)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
荻沼 政之 大阪大学, 微生物病研究所, 助教 (50825966)
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| Project Period (FY) |
2020-10-02 – 2023-03-31
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| Keywords | イオンチャネル / 濃度勾配 / 遺伝子組換え魚類 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は以下の進捗が見られた。
（１）MDCKに、Hv1野生型及び、Hv1変異体を強制発現させ、アクチンフィラメントの量に差が生じうるかを検証した結果、Hv1野生型においてのみアクチンフィラメントの量が変化したため、MDCKにおけるアクチン線維の制御はH+チャネル依存的に生じていると考えられた。また、Hv1ノックアウトマウスにおいて鬱病様症状が緩和されるメカニズムを理解するため、野生型マウスとHv1ノックアウトマウスを用いて、若齢マウス・加齢マウスの脳サンプルについてtranscriptome解析を行った。Hv1欠損の加齢マウスでは野生型マウスと比較してオキシトシン受容体、セロトニン受容体、ドーパミン受容体などGPCRの発現が亢進していることが明らかとなった。また、今回のtranscriptome解析の結果を過去のデータベースと比較した結果、Hv1欠損の加齢マウスでは野生型マウスと比較して脳の加齢が進んでいない状態にある、という結果が判明した。
（２）Hv1がゴルジ装置でのpH環境の制御に関わる可能性を検討するため、正常型Hv1とイオンチャネル不活性型Hv1をそれぞれ安定に発現する２種類の細胞株（マクロファージ系培養細胞RAW264.7および神経芽細胞Neuro2A）を構築した。
（３）[研究分担者 荻沼]昨年度までに作製したpHレポーターキリフィツシュに加えて、オートファジー活性や細胞内ATP濃度を可視化するレポーターフィッシュの樹立を完了し、これらの胚を生きたまま詳細観察できる系を確立した。休眠胚と通常発生中の胚を用いてCAGE-seq解析を用いた網羅的な比較転写解析を行った結果、細胞内pHを制御すると考えられる遺伝子（pH制御候補遺伝子）が休眠時に発現変動することが分かった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
交付申請時に計画した各研究項目について、「6.研究実績の概要」に記述した様に着実に進捗が見られたため
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度の成果を踏まえ、各研究を発展させるとともに、研究課題内および領域内での連携を更に強めることで、pH場について共同研究を進める。
[研究代表者 岡村]（１）ミクログリアを用い、エンドソームにおけるHv1の活性を電気生理学的に評価する。Hv1含有小胞がアクチン線維を制御する介在分子を明らかにすることで、分子メカニズムに迫れることを期待し、Hv1含有小胞と物理的に相互作用する可能性のある候補分子を探索する。（２）今回構築した、正常型Hv1とイオンチャネル不活性型Hv1をそれぞれ安定に発現する細胞株を用いて、レクチンアレイによる糖鎖修飾を比較し、ゴルジにおけるHv1によるpH環境が糖鎖修飾に関わるかを検証する。（３）サンゴのゲノム情報から、プロトンチャネルについて、cDNA情報の探索を行い、複数cDNA情報が得られた場合にはその一次構造から分子間での分子構造の違いを推定する。
[研究分担者 荻沼]（１）今回作製したレポーターフィッシュをlight sheet 顕微鏡を用いて、休眠胚の代謝状態を一細胞レベルで調べる事で細胞内pHを制御する機構を調べる。（２）今回見つかったpH制御候補遺伝子のノックアウト個体の作成を行い、休眠胚の細胞内pHを制御する機構を解析する。（３）Hv1のノックアウトキリフィッシュを作製する。
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