2022 Fiscal Year Annual Research Report
Studies on critical periods of synapse pruning in the developing cerebellum
| Project Area | Inducing lifelong plasticity (iPlasticity) by brain rejuvenation: elucidation and manipulation of critical period mechanisms |
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| Project/Area Number |
20H05915
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
狩野 方伸 東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 教授 (40185963)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
菅谷 佑樹 東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 講師 (00625759)
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| Project Period (FY) |
2020-11-19 – 2025-03-31
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| Keywords | シナプス刈り込み / 生後発達 / 小脳 / 登上線維 / プルキンエ細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
令和4年度は、引き続き、転写因子Myocyte enhancer factor 2 (MEF2) familyのうち、プルキンエ細胞に強く発現する分子のプルキンエ細胞特異的KOマウスを解析した。その結果、登上線維の樹状突起への進展が軽度に障害されており、プルキンエ細胞の細胞体に余剰な登上線維シナプスが残存していることが明らかになった。一方、平行線維からの興奮性シナプス入力や抑制性シナプス入力に異常は見られなかった。また、小脳のRNA-sequencingを行った結果、プルキンエ細胞特異的KOマウスにおいて、9個の遺伝子が有意な発現低下を示し、62個の遺伝子が有意な発現上昇を示した。さらに、プルキンエ細胞に強く発現する転写因子MEF2 familyのうちで、上記とは別の分子のプルキンエ細胞特異的KOマウスを解析した。その結果、生後20日から30日において、2本以上の登上線維によって支配されるプルキンエ細胞の割合が野生型マウスに比べて有意に高いことが判明したが、生後15日までは異常が認められなかったことから、生後16日以降の登上線維シナプス刈り込みに異常があることが考えられた。
また、プルキンエ細胞においてP/Q型電位依存性カルシウムチャネル(P/Q-VDCC)によって活性化されると考えられるMEF2 familyとは別の転写因子の解析を継続した。この転写因子をプルキンエ細胞特異的にノックダウン（KD）すると生後2週目後半から3週目の後期刈り込み過程が障害され、登上線維の樹状突起へのシナプス領域の拡大の程度が弱くなるが、これらがP/Q-VDCCと同じ分子パスウェイを介することを示す結果を得た。また、この転写因子をKDした小脳では、一部のセマフォリンの発現が上昇しており、このセマフォリンをプルキンエ細胞で過剰発現すると、転写因子のKDと同様の登上線維シナプス刈り込みの異常を生じた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
令和4年度は8月まで、COVID-19の感染の広がりがあったが、秋以降には感染状況は好転し、研究への影響は軽微となった。プルキンエ細胞に発現するMEF2 family分子のうち、令和2年から解析していた分子については、この分子のプルキンエ細胞特異的KOマウスの登上線維シナプス刈り込みに関する電気生理学的および形態学的解析をほぼ終了した。また、もう一つのMEF2 family分子についても、そのプルキンエ細胞特異的KOマウスの電気生理学的解析がほぼ終了し、形態学的データを取得済みであり、今後その解析を進めることになる。プルキンエ細胞においてP/Q-VDCCによって活性化されるMEF2 familyとは別の転写因子の登上線維シナプス除去における役割についての研究は、予定をやや上回るペースで進んでいるといえる。特に、この転写因子が一部のセマフォリンの発現を抑制することによって登上線維シナプス除去を促進していると考えられる結果を得たことは、これまで知られていたセマフォリンの登上線維シナプス発達への作用とP/Q-VDCCを介するカルシウム流入との関係を明らかにしたことになり、大きな進歩と考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
MEF2 family転写因子の登上線維シナプス刈り込みにおける役割については予定した解析をほぼ終了した。今後は、当該分子のプルキンエ細胞特異的ノックアウトマウスの網羅的行動解析に注力する。一方、プルキンエ細胞においてP/Q-VDCCによって活性化されると考えられる転写因子の役割についてさらに研究を進める。この転写因子をKDした小脳で発現が上昇しているセマフォリンの過剰発現と当該転写因子のKDを同時に行った場合、登上線維シナプス刈り込みがどのようになるかを調べる。また、このセマフォリンのプルキンエ細胞でのKDが当該転写因子のKDの効果を軽減するかどうかを調べる。
今後、新たにシナプスオーガナイザー分子の登上線維シナプス発達における役割に注目する。シナプスオーガナイザーは、細胞外ドメインを介して選択的相互作用をすることで、シナプス前部と後部をマッチングさせてシナプス形成を誘導する一群の分子で、このうち、LAR-RPTPsはシナプス前部オーガナイザーである。申請者らの予備的実験で、LAR-RPTPsに属する分子のノックアウト（KO）マウスでは、登上線維の樹状突起移行が明らかに障害されていることが示唆されている。そこで、この分子の局在を免疫組織学的手法で調べ、小脳の部位（小脳小葉）の違いによって登上線維の樹状突起移行に差があるかを明らかにする。さらに、このKOマウスにおいて登上線維シナプス除去に異常がみられるかを、新生児期から生後4週目まで網羅的に調べるとともに、登上線維からプルキンエ細胞へのシナプス応答を電気生理学的に精査する。並行して、microRNAによってこの分子を登上線維特異的にKDすることを試みる。
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