2020 Fiscal Year Annual Research Report
Elucidation of the mechanisms of multiple localization and its regulation of cellular proteins
| Project Area | Multifaceted Proteins: Expanding and Transformative Protein World |
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20H05929
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| Research Institution | Kyoto Sangyo University |
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Principal Investigator |
遠藤 斗志也 京都産業大学, 生命科学部, 教授 (70152014)
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| Project Period (FY) |
2020-11-19 – 2025-03-31
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| Keywords | Msp1 / ミトコンドリア / TAタンパク質 / タンパク質配送の校正 / ER / GETシステム |
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| Outline of Annual Research Achievements |
われわれは，タンパク質の配送にはやり直し(校正)機構が存在すること，すなわちミトコンドリア外膜のAAA-ATPアーゼのMsp1が，ミトコンドリア外膜に誤配送された膜タンパク質を検出して引き抜き，ER膜に送り込んで分解するか配送をやり直すかが決まることを見出した。本研究では，Msp1による配送校正の基質の範囲は何か，他のオルガネラでも校正が起こるのかどうか，オルガネラ間での基質タンパク質の移動にオルガネラ間コンタクト部位やシャペロンなどの因子は関与するか，という問いに答えることで，校正の全体像を明らかにすることをめざしている。さらに，他の細胞内局在の校正因子や他に多重局在例の検索，解析への展開も視野にいれている。
これまでに，Msp1によってミトコンドリア外膜から引き抜かれた誤配送テイルアンカー(TA)タンパク質がERに移動することを，蛍光顕微鏡によるタイムラプス観察で検証することに成功した。さらに，Msp1によって引き抜かれたPex15Δ30などの誤配送TAタンパク質が，Msp1以外のどのような因子に依存してERに移行するかを検討した。その結果，Msp1によって引き抜かれたPex15Δ30のミトコンドリアからERヘの移行は，サイトゾルのシャペロンGet3とそのER上の受容体Get1/2（合わせてGETシステムと呼ぶ）に依存することが明らかになった。しかしMsp1を過剰発現すると，GETシステムが欠損してもPex15Δ30はERに移行したので，効率は低いながら，GETシステムに依存しないでミトコンドリアからERに移行する経路があることがわかる。この経路がミトコンドリア-ERコンタクトを介するのか，は興味深い問題であるが，今後の検討課題である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまでに，Msp1によってミトコンドリア外膜から引き抜かれた誤配送テイルアンカー(TA)タンパク質がERに移動することを，蛍光顕微鏡によるタイムラプス観察で検証することに成功した。すなわち，ペルオキシソームからミトコンドリアに誤配送されるモデル基質Pex15Δ30にケイ光タンパク質を融合させたmNG-Pex15Δ30を 薬剤(β-estradiol)誘導的に一時的に発現させ，その分解をDoa10欠損により抑制した。次に，Pex15Δ30の発現をオフにし、同時にMsp1の発現をガラクトース誘導型プロモータ 等でオンにしたときの基質の移動を，蛍光顕微鏡でモニターし，いったんミトコンドリアに誤配送されたPex15Δ30がミトコンドリアからERに移動することを説得力ある形で示すことができた。
次にMsp1によって引き抜かれた誤配送TAタンパク質が，Msp1以外のどのような因子に依存してERに移行するかを検討した。新規合成されたER行きのTAタンパク質はサイトゾルのTAタンパク質専用のシャペロンGet3とそのER上の受容体Get1/2（合わせてGETシステムと呼ぶ）によってERへの配送が行われる。そこでミトコンドリアに誤配送されたPex15Δ30もこれらGETシステムに依存してERに移行するかどうかをget3Δ株，get1Δget2Δ株を使って調べた。その結果，Msp1によって引き抜かれたPex15Δ30のミトコンドリアからERヘの移行はGETシステムに依存することが明らかになった。しかしMsp1を過剰発現すると，促進される予備的結果を得ているので，効率は低いながら，GETシステムに依存しないでミトコンドリアからERに移行する経路があることがわかる。この経路がミトコンドリア-ERコンタクトを介するのか，は興味深い問題であるが，今後の検討課題である。
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| Strategy for Future Research Activity |
Msp1がミトコンドリア以外のオルガネラでも誤配送タンパク質の配送やり直しに関わるかどうかを検討するために，ERをはじめとする様々なオルガネラにMsp1を異所発現する系を作製する。具体的にはMsp1のN端膜貫通（TM）配列を，ミトコンドリア，ER, ペルオキシソームのNアンカー型膜タンパク質のTM配列に置き換えたタンパク質を作製する。野生型Msp1はミトコンドリアだけでなく，ペルオキソームに一部局在するので，ミトコンドリアのみ，ペルオキシソームのみに存在するMsp1を作製する。さらに，ERでMsp1と同様の役割を果たす可能性があるER膜上のP型ATPアーゼSpf1の欠失株について，どのような膜タンパク質の局在が影響を受けるかどうかを検討する。spf1Δ株ではMsp1の局在がミトコンドリアからERに変わることを見出しているので，この移動にMsp1のATPアーゼ活性やオリゴマー形成活性が関わるかについて，Msp1変異体を用いて検討する。上記のMsp1異所局在型発現系とSpf1欠失株を組み合わせて，細胞内の膜タンパク質の局在の撹乱とその品質管理についての情報を得ることをめざす。加えて，ミトコンドリア外膜に誤配送されたペルオキシソーム膜タンパク質は外膜上のAAA-ATPアーゼであるMsp1を介してペルオキシソームへ再配送されるのか，を検討するとともに，昨年度から引き続きクライオ電子顕微鏡解析によるMsp1の構造解析を行う。具体的にはMsp1-基質複合体を酵母細胞内から単離し，立体構造解析を進める。
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