2021 Fiscal Year Annual Research Report

針状ケイ酸体を細胞が産生、運搬、繋げるカイメン骨片骨格形成機構

Planned Research

Project Area	Material properties determine body shapes and their constructions
Project/Area Number	20H05942
Research Institution	Kyoto University
Principal Investigator	船山典子京都大学, 理学研究科, 准教授 (30276175)
Project Period (FY)	2020-11-19 – 2025-03-31
Keywords	作業員細胞 / 自律分散システム / 自己組織化 / 骨片 / 骨片運搬
Outline of Annual Research Achievements	１）　骨片骨格形成に関しては、黒田純平博士の助言により、幼弱個体での骨片を繋ぐコラーゲンマトリクスの蛍光可視化に成功した。特定のコラーゲンのmRNA発現により骨片を繋ぐ細胞と強く示唆される細胞の同定に成功しており、論文としてまとめていくよう進めている。２）　Luxendo社QuViSPIMの稼働に予想外の時間を要し、非常に苦心している。撮影前の顕微鏡調整、斜めから撮影した画像を通常のZスタックに変更するプロセッシングの取得のためにLuxendo社から国際オンラインで４回の講習、顕微鏡の不具合修理３回、英語メールを多数やり取りし、年間を通じて辛抱強く取りみ、片側からの撮影像であれば、確率は低いがラフな3次元像を得ることも出来るようになった。しかし、3次元像の微調整法は不明な点が多く問い合わせ中である。領域の共同研究利用では、最終的な微調整は共同研究者本人に行ってもらう以外に無く、3次元像の微調整法を明確にすることが次の課題である。出来るだけ撮影範囲を狭め、撮影したい部分が片側から撮影など限定的、設備や時間がかかること、個々のサンプルに対する条件検討の試行錯誤が多段階で必要である点を充分理解いただいた上で共同研究に取り組む必要がある。 3）　作業員細胞のライブイメージングの為の、カワカイメンゲノムへの遺伝子導入法の確立の試みは、学部4回生が取り組み、一過的な遺伝子導入法の取得、ゲノム挿入のためのプラスミド構築を行い、2種のプラスミドの導入法を試行錯誤しているが、現在までのところ成功に到っていない。ただし、その過程で2遺伝子を一過的に発現させることに成功する等、今後の展開に役立つ成果も得られている。４）芽球骨片の運搬と配置に関する細胞・分子機構解明に関しては、別の研究費で平行して行ってきた解析の上に、アルバイト学生と共にRT-PCRによる遺伝子クローニングを行っている。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason ライトシート型顕微鏡が1年の間に3度ほど不具合がありそのトラブルシューティングに労力と時間がかかり、さらにコロナ渦で部品輸入にも時間がかった。加えて、日本での1号機であることから代理店の方も使用法の詳細を把握なさっていない部分も多々あり、研究者ら自らがLuxendoに問い合わせ、また問題解決のためのチェック事項をリストアップするなどが必要であり、想像以上に時間と労力を要したため、予定より遅れている。国内外で未確立のカイメンゲノムへの遺伝子挿入法の確立は挑戦的なプロジェクトであり、計画した実験の準備は完了し実際に実験を行っているが成功に到れず、詳細な条件を試行錯誤中である。
Strategy for Future Research Activity	ライトシート型顕微鏡については、斜めからの撮影像をZスタックにするプロセッシングについて、カワカイメン骨片骨格の撮影を例に、ある程度手法を習得出来たと考えている。カイメン骨片骨格に関してはこの経験値の上に、着目点を絞った解析を行う。領域の共同研究機器であるため、共同研究が使命であるが、個々のサンプルに関し、レーザー調整から多段階の微調整が必要であるため、その度、試行錯誤して進めるしかない。共同研究に関しては,状況を理解していただいた上で、成功出来そうなサンプルから挑戦したい。カワカイメンゲノムへの遺伝子挿入法に関しては、最近の他の動物での知見を参考に、これまでとは異なる手法も試みる予定である。2021年度後半に参加くださった特定研究員と大学院生との2人体制で鋭意取り組む。比較的順調に進んでいる芽球骨片運搬については、クローニングした遺伝子がどの細胞でいつ発現しているか、WISHを用いた解析を進める。骨片骨格形成に関しては、骨片を繋ぐ細胞に関する論文を投稿、発表する。