2013 Fiscal Year Annual Research Report
Ｉｎ ｓｉｔｕ計測による脂質、膜受容体の活性化機構の解明
| Project Area | Integrative understanding of biological processes mediated by transient macromolecular complexes; New technology for visualizing physiologically metastable states. |
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| Project/Area Number |
21121006
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
白川 昌宏 京都大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (00202119)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
森川 耿右 公益財団法人国際高等研究所, その他部局等, 名誉教授 (80012665)
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| Project Period (FY) |
2009-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | NMR / 脂質シャペロン / 脂肪酸結合蛋白質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究ではin-cell NMRを用いて、細胞内で形成される蛋白質複合体の構造や運動性・安定性をその場 (in situ) 観察・計測する手法の開発を目指した。
・脂肪酸シャペロン蛋白質FABP4の解析
リガンド結合により活性化された蛋白質はしばしば過渡的で不安定なためin vitroでの解析が困難であるので、細胞内等、in situで蛋白質の構造を観察する必要がある。モデル系として、FABP(Fatty Acid Binding Protein)4を用い、in-cell NMRによる細胞内での動的状態の解析を行うための準備として、まずin vitroで解析した。FABP4は細胞内における脂肪酸輸送に関与する蛋白質で、遊離脂肪酸や類縁体と結合し細胞内の特定部位に移動する。試験管内でのNMR緩和時間測定から、基質非結合状態でFABP4のhelix-loop-helix (HLH)領域がミリ秒の時間スケールで複数の立体構造間で有意に揺らいでいること、更にモデル基質であるANS(1,8-anilinonaphthalene sulfonate)の結合によりこの揺らぎが抑制されることがわかった。またANS結合によってHLHとは異なる部位で運動性の上昇が見られた。この構造揺らぎは、核内移行に際し、或いは移行後の他分子との相互作用を促進するものである可能性がある。
・in-cell 19F-NMR
より簡便・高感度なin-cell NMR法を目指し、19F-NMRの適用を試みた。免疫抑制剤FK506結合蛋白質(FKBP12)のフェニルアラニンを19F標識し、in-cell 19F-NMR測定を行ったところ、HeLa細胞内で良好な1次元スペクトルを得る事ができ、外部投与のFK506やラパマイシンとの結合も容易に検出できることが示された。
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| Research Progress Status |
26年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
26年度が最終年度であるため、記入しない。
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Research Products
(7 results)
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[Journal Article] The unexpected role of polyubiquitin chains in the formation of fibrillar aggregates.2015
Author(s)
Morimoto D,Walinda E, Fukada H, Sou YS, Kageyama S, Hoshino M, Fujii T, Tsuchiya H, Saeki Y, Arita K, Ariyoshi M, Tochio H, Iwai K, Namba K, Komatsu M, Tanaka K, Shirakawa M.
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Journal Title
Nat Commun.
Volume: 6
Pages: 6116-6116
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
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[Journal Article] An in-cell NMR study of monitoring stress-induced increase of cytosolic Ca2+ concentration in HeLa cells2013
Author(s)
Dambarudhar Shiba Sankar Hembrama, Takahiro Haremakia, Jumpei Hamatsua, Jin Inouea, Hajime Kamoshidaa, Teppei Ikeyaa, Masaki Mishimaa, Tsutomu Mikawab, Nobuhiro Hayashic, Masahiro Shirakawad, Yutaka Ito
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Journal Title
Biochem Biophys Res Commun
Volume: 438
Pages: 653-659
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
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