2022 Fiscal Year Annual Research Report
過渡的タンパク質複合体の高速構造解析プラットフォームの構築
| Project Area | Multi-scale platform for untangling physiological complexity |
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| Project/Area Number |
21H05112
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| Research Institution | Kansai Medical University |
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Principal Investigator |
寿野 良二 関西医科大学, 医学部, 准教授 (60447521)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
加藤 貴之 大阪大学, 蛋白質研究所, 教授 (20423155)
藤田 大士 京都大学, 高等研究院, 准教授 (20713564)
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| Project Period (FY) |
2021-08-23 – 2024-03-31
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| Keywords | クライオ電子顕微鏡単粒子解析 / X線結晶構造解析 / GPCR / バイアスドリガンド / シグナル伝達 / 創薬 / 膜タンパク質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
【概要】本研究領域では、多元的アウトプットとして現れる複雑な生理作用を、分子（寿野班）、細胞（井上班）、個体（櫻井班）、制御（斉藤班）といった次元に分解して検証し、分子、細胞、個体各スケールにおける「素過程」の重ね合わせの形にて記述・可視化を実現する。寿野班は分子フェーズを担当し、GPCR A, Bを介したシグナル伝達機構の全貌をX線結晶構造解析およびクライオ電子顕微鏡の単粒子解析（Cryoelectron microscopy single particle analysis : Cryo-EM SPA）によって原子分解能レベルで明らかにする。
【目的】バイアス型リガンド結合型GPCR A, BのX線結晶構造解析によるシグナル選択性の解明、GPCR A, Bとシグナル伝達因子複合体の構造解析によるシグナル伝達機構全貌の解明、ケージ技術とCryo-EM SPAを融合した迅速構造決定プラットフォームの開発を目指す。
【研究成果】 本年度は、X線結晶構造解析のためのコンストラクト作製、発現、精製と、Cryo-EM SPAのためのGPCR A, BとGタンパク質の複合体形成条件を検討し、それぞれGタンパク質選択的作動薬、バランスド作動薬存在下で安定な複合体を得ることができた。複合体について２００ｋVの電子顕微鏡でスクリーニングし、GPCR Aの選択的リガンド、非選択的リガンド結合状態で3００ｋVのクライオ電子顕微鏡単粒子解析（Cryo-EM SPA)によりそれぞれ3.24, ３．０A分解能での構造決定に成功した。GPCR Bについても選択的リガンド２種、非選択的リガンド結合状態では３００ｋVのCryo-EM SPAによりそれぞれ３．２６，2.9, 2.76A分解能で構造決定した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
想定より６ヶ月ほど早く目的の複合体の構造すべて決定でき、さらに別のリガンドとの結合状態構造も決定できたから。
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| Strategy for Future Research Activity |
GPCR A, BについてGタンパク質複合体、バイアス型リガンド、非選択性リガンド結合型構造が当初の予定より早く構造決定できた。共同研究者と構造情報をもとにしてシグナル伝達機構に重要と考えられるアミノ酸について変異体を作成し、バイアス型リガンドの作用機序を明らかにする。また、構造情報をもとにした薬剤開発を行い、その性質を検討する。構造情報をもとにして設計した化合物開発を達成し、上述の結果をまとめて論文を投稿する。今後はアレスチン結合型構造決定を目指して、得られた構造情報とすでに決定した構造をもとに、その相違点から副作用のないGタンパク質シグナリング選択性リガンドの開発に重要な知見を提供する。
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