2022 Fiscal Year Annual Research Report
オピオイド受容体の網羅的シグナル解析による薬理経路の同定
| Project Area | Multi-scale platform for untangling physiological complexity |
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| Project/Area Number |
21H05113
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
井上 飛鳥 東北大学, 薬学研究科, 教授 (50525813)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
生田 達也 東北大学, 薬学研究科, 助教 (80894815)
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| Project Period (FY) |
2021-08-23 – 2024-03-31
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| Keywords | GPCR / オピオイド / バイアス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究課題の対象GPCRであるカッパーオピオイド受容体(KOR)に対するリガンドとして斉藤班が設計・有機合成した41種類のモルヒナン骨格構造類縁体について、KORを介したGタンパク質活性（GiおよびGo）とアレスチン活性をNanoBiT-GPCRシグナルアッセイを用いて評価した。その結果、約半数の化合物がナルフラフィンと同等かそれ以上の親和性でKORに対する作動活性を示した。高親和性の化合物のうち大半はGタンパク質と比べてアレスチンに対して部分作動活性を示し、Gタンパク質バイアス型であることがわかった。領域内の構造研究の変異体実験を見据えて、デルタオイピオイド受容体（DOR）の検討を行った。その結果、N末にシグナルシークエンスとFLAGエピトープタグを付加したDORコンストラクトにおいて、プラスミドトランスフェクション量依存的に膜発現が低下することを確認した。既存のDOR構造からリガンドドッキングを元に予想したKNT-127のリガンド認識アミノ酸残基について、フローサイトメトリー解析を行い、発現量が同等になる野生型のプラスミドトランスフェクション量を検討し、NanoBiT-GPCRシグナルアッセイを行った。その結果、KNT-127のGi活性が大きく低下する変異体を見出した。この変異体では、内因性リガンドのエンケファリンの活性は維持されていた。従って、リガンドの認識機構と受容体活性化機構に差があることがわかった。関連研究として、ヒトとマウスのオレキシン受容体（OX1R、OX2R）に対するシグナル活性をTGFα切断アッセイを用いて評価する実験系を構築し、斉藤班が合成したオレキシン受容体作動薬がマウス受容体においてもOX1R選択的であることを示した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初計画に沿った研究を実施することができた。当初計画外の成果として、オレキシン受容体に関する領域内共同研究の実施、本研究で確立したリガンドドッキングを応用した微生物代謝物カルコンの生合成経路の解明が挙げられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究によって得られたKORリガンドの構造活性相関情報を元に、斉藤班が親和性・シグナルバイアス活性を強めた設計の構造類似体を合成しており、本研究者がKORに対する活性評価を行う。同様に、昨年度までに得られたDORの構造活性相関から、KNT-127構造類似体のGタンパク質活性とアレスチン活性を評価し、親和性・シグナルバイアス活性を増強したリガンド取得を狙う。さらに、寿野班が進めているKORとDORの構造解析情報を元に、分子動力学解析によりリガンド結合モデルを検証するとともに、シグナルバイアス性に関わる構造基盤を調べる。さらに、本年度確立した変異体アッセイ系を用いて、KORとDORの変異体解析を進め、リガンド結合やシグナルバイアス活性を担う構造基盤を明らかにする。
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