2022 Fiscal Year Annual Research Report
Bottom-up creation of cell-free molecular systems: surpassing nature
| Project Area | Bottom-up creation of cell-free molecular systems: surpassing nature |
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| Project/Area Number |
21H05228
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| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
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Principal Investigator |
松浦 友亮 東京工業大学, 地球生命研究所, 教授 (50362653)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
木賀 大介 早稲田大学, 理工学術院, 教授 (30376587)
三浦 夏子 大阪公立大学, 大学院農学研究科, 准教授 (80724559)
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| Project Period (FY) |
2021-09-10 – 2026-03-31
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| Keywords | 進化分子工学 / 分子システム |
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| Outline of Annual Research Achievements |
2022年度は、GPCRの進化実験、膜タンパク質合成に適した無細胞系の評価、要素間相互作用計測のための予備検討を行った。
これまでにGタンパク質共役型受容体（GPCR）の進化分子工学を実現する分子システムを構築した（Nakai et al., Anal Chem, 2022）。2022年度は、２つのGPCR、エンドセリンレセプターtypeB（ETBR）とアデノシン受容体（A2aR）のどの位置に変異を導入すると熱安定化や基質認識能力が変化させることができるかを計算科学を用いて推測した。前者は、千葉大学の村田研究室と、後者は、名古屋大学の清中研と共同で実施した。その結果、変異を導入する位置を決定した。また、GPCRの進化に重要な適切な選択圧を与える実験系の構築を行った。具体的には、熱安定性の進化については、適切な温度条件を、基質認識能力の進化については、適切なリガンドを化学合成した。
共同研究者の岩手大の西山研では、これまでに無細胞タンパク質合成系PURE systemを膜タンパク質合成用にカスタマイズしたシステムを構築している。一方で、一回膜貫通タンパク質でしか試験されない。そこで四回膜貫通のEmrEを用いて、活性のある膜タンパク質を合成できるかの検討を行った。プロテアーゼ処理では、EmrEの膜挿入が西山らのシステムは向上していることがわかった。今後、活性を有するのかを検討してゆく。
分子システムの要素間相互作用を測定するために、非接触分注機（Echo）のセットアップを行った。本研究課題は、分担者の木賀研究室と共同で実施した。分注コマンドファイルを生成するプログラムを作製した。次に、Echoを用いて３種類の蛍光物質を様々なパターン、濃度で分注するコマンドを実施して、分注の精度と再現性を確認した。今後、分子システムを構成する要素間相互作用を計測するために使用する準備を整えた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
GPCRの進化実験に関しては、進化実験が成功するときと失敗するときがあるという実験の再現性に問題があり、現在トラブルシューティングしているところ。また、要素間相互作用を測定するために大量の実験データを取得する必要があるが、分注ロボットの制御などに苦戦している。
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| Strategy for Future Research Activity |
2023年度は、GPCR遺伝子ライブラリーの作製と評価、膜タンパク質に最適化したPURE systemの評価、PPK2を用いた分子システムの構成要素間の相互作用測定を行う。
これまでにGタンパク質共役型受容体（GPCR）の進化分子工学を実現する分子システムを構築した（Nakai et al., Anal Chem, 2022）。2023年度は、遺伝子ライブラリーの構築に取り組む。これまでに理論計算から機能向上に寄与する可能性が高いと予測された場所に飽和変異を導入したライブラリーを作製し、作製したライブラリーが狙い通りの多様性を持っていることを次世代シーケンサー解析により確認する。
岩手大の西山研との共同研究では、EmrEの膜挿入メカニズムをプロテオミクスとトランスポート活性測定を組み合わせて解明する。
ポリリン酸キナーゼ２（PPK2）を用いた新しい分子システムを構築することを目指す。PPK2は、ポリリン酸を供与基質として、NMP及びNDPをNTPにリン酸化する酵素である。NTPを精製する酵素には様々あるが、PPK2はポリリン酸という非常に安価な基質を利用するため、最も安価にNTPを生成する反応を触媒する。従って、無細胞タンパク質合成系のエネルギー再生（ATP、GTP）反応を担う酵素として有望である。PPK2を用いたNTP合成反応は、10成分から構成される無細胞分子システムである。そのうち7成分の濃度を網羅的に変化させてNTP合成活性を向上させるため、分担者の早稲田大学の木賀研究室と共同で384 wellで反応液混合、反応させ、生成したNTP濃度を計測する方法論を確立した。今後システムの最適化と要素間相互作用を解明してゆく。
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