2023 Fiscal Year Annual Research Report
Mechanism for building diversity of neural projections responsible for behavioral selection
| Project Area | Census-based biomechanism of circuit construction and transition for adaptive brain functions |
|---|
| Project/Area Number |
21H05241
|
|---|
| Research Institution | Hokkaido University |
|---|
Principal Investigator |
藤山 文乃 北海道大学, 医学研究院, 教授 (20244022)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
大野 伸彦 自治医科大学, 医学部, 教授 (10432155)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2021-09-10 – 2026-03-31
|
| Keywords | 大脳基底核 / ドーパミン |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究計画では、適応行動の選択の際に特異的な活動を示す神経細胞に、B01班が作成するウイルスベクタを感染させ、この感染細胞の遺伝子プロファイルを明らかにするとともに、この神経細胞の軸索が投射するポストシナプス側の神経細胞の詳細な遺伝子プロファイルを明らかにする。申請者らの先行研究によると、一つのドーパミン神経細胞が投射する線条体神経細胞は計算上75,000個と類推される。この大量な遺伝子情報を解析するためには、C01班のハイスループット遺伝子解析技術と連携する。この技術に、A01藤山班の投射軸索完全可視化、三次元電子顕微鏡解析を含む超解像度形態解析技術を有機的に連携させることで(神経回路seq)、「行動選択に伴い、構造的・遺伝的に規定された神経回路がドーパミンの影響によってどのように遷移していくのか」という学術的問いに迫る。これまでの研究では、経シナプス性に運ばれるウイルスベクタを用いて、世界で初めてドーパミン神経細胞の経シナプス標識が可能であることを確認した。具体的には中脳の黒質緻密部にAAV1-hSyn1-EBFP-Creを注入し、線条体のどのニューロンにCreが運ばれたのかを検証した。AAV1ウイルスは当然順行性のみならず逆行性に運ばれうるため、線条体の投射ニューロンが標識された場合は、順行性に標識されたものか逆行性に標識されたものかの区別がつかない。しかし今回線条体のインターニューロンが標識されており、ドーパミン神経細胞の経シナプス標識が成功したことを確認できた。これまで世界的にもドーパミン神経細胞の経シナプス標識の報告はなく、この所見の更なる検証を重ねる予定である。また、分担研究者の大野はdAPEX2-AAVを用いた軸索標識に成功しており、今後はこの両者の手法を組み合わせ、ドーパミン神経軸索投射の微細構造を確認していく予定である。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまで世界的にも成功例の報告がないドーパミン神経細胞の経シナプス標識を確認できたことで、研究分担者の大野との共同研究の道筋が見えてきた。もしこの経シナプス標識ができなかった場合は、さらに複雑な標識実験が必要となったはずだが、この成功のおかげで順調な進捗となっている。さらに分担研究者の大野のグループが、dAPEX2-AAVを用いて、特定の軸索や樹状突起を標識して、その微細構造を電子顕微鏡を用いて観察する方法を確立し、複数の業績をあげてきている。今後は代表者のグループが可視化したプレおよびポストのニューロンの相互関係を、大野らのグループの3次元電顕解析につなげる予定である。
|
| Strategy for Future Research Activity |
研究代表者等は、AAV1（順行性経シナプス性ウイルスベクタ）を用いて、世界で初めてドーパミン神経細胞の経シナプス標識が可能であることを確認した。しかし、ドーパミン神経細胞にはその遺伝学的背景により複数のサブポピュレーションが存在する。現在は、昨年の報告より一歩進んで、そのサブポピュレーションごとの投射様式と投射先をウイルスベクタを細かく打ち分けることによって解析中である。
一方、分担者の大野のグループはdAPEX2-AAVを用いて、特定の軸索や樹状突起を標識して、その微細構造を電子顕微鏡を用いて観察する方法を確立した。現在、この両者を融合し、ドーパミンニューロンと接続するニューロンの標識と3次元電顕解析を行うことに挑戦しつつある。具体的にはドーパミン細胞を小胞体局在型dAPEX2で標識し、投射先ニューロンをCre組換えで標識を発現するミトコンドリア局在型のdAPEX2で標識することである。この実験の中で、神経細胞の細胞体や樹状突起のみならず、軸索遠位部まで標識するための条件検討を行う予定である。さらに、投射元、投射先の神経細胞の遺伝子情報と投射様式の関係を調べるために領域内の共同研究により、single cell RNA sequencing法を組み合わせる。現在手動で切り出し、投射元および投射を受けた細胞のサンプリングを行い、RNA抽出を行う。既にドーパミン神経細胞を健康な状態で切り出し、質の良いRNAを抽出することに成功している。遺伝学的解析に関してはC01班との連携で、神経細胞の遺伝子発現プロファイルを取得し、ついでt-SNE解析によって、遺伝子発現プロファイルに基づいて各神経細胞をクラスタリング（分類）する予定である。
|
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
[Presentation] Structural and functional connectivity of cerebrospinal fluid-contacting neurons to regulate locomotion in the mouse spinal cord2023
Author(s)
Yuka Nakamura, Miyuki Kurabe, Mami Matsumoto, Tokiharu Sato, Satoshi Miyashita, Kana Hoshina, Yoshinori Kamiya, Kazuki Tainaka, Hitoshi Matsuzawa, Nobuhiko Ohno, Masaki Ueno
Organizer
第46回日本神経科学大会
-
-
-
-
-
-
-
-
