2021 Fiscal Year Annual Research Report
細胞内分子構造動態を解明するためのクロススケールIn-cell NMR解析
| Project Area | New cross-scale biology |
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| Project/Area Number |
21H05250
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| Research Institution | Chiba University |
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Principal Investigator |
西田 紀貴 千葉大学, 大学院薬学研究院, 教授 (50456183)
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| Project Period (FY) |
2021-09-10 – 2026-03-31
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| Keywords | In-cell NMR / 動的構造平衡 / Ras / Rac1 / KO細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、我々がこれまでに開発してきたIn-cell NMR法をさらに発展させ、①細胞内構造ダイナミクス、②細胞内制御因子の影響、③特定の細胞内局所環境の影響を解明する新規In-cell NMR技術を開発することを目指した。
①細胞内ダイナミクス：低分子量GTPaseのRac1を解析対象として、細胞内動的構造平衡の解析法の確立を行った。Ile側鎖δ１メチル基を安定同位体標識したRac1を細胞内に導入しIn-cell NMR測定を行った結果、P29S変異体では細胞内で一部GTP型に由来するシグナルが観測され細胞内での恒常的な活性化が生じていることが示された。また、in vitroと比較して一部のシグナルに顕著な広幅化が観測され、細胞内環境下ではGDP結合型Rac1のもつ動的構造に変調が生じていることが明らかになった。
②細胞内制御因子の影響：RasのGTP加水分解を促進する細胞内制御因子であるRASA1とNF1をノックアウトした細胞をCRISPR-Cas9系を用いて樹立し、RasのIn-cell NMR観測を行った。その結果、GAP非感受性のG12V変異体ではKOの影響が観測されなかったものの、T35S変異体ではNF1KO細胞においてのみ顕著なGTP型割合の増加が観測されたことから、細胞内環境下における制御因子の寄与を定量的に見積もる手法を確立することに成功した。
③細胞内局所環境におけるIn-cell NMR観測：RasのC末端に存在する超可変領域（HVR）を含む全長Rasを細胞内に導入し、共焦点顕微鏡による局在化の観測を行った。その結果、野生型全長Rasでは導入時間依存的なRasの細胞膜の局在化が観測される一方、脂質修飾部位C185をSerに置換した変異体では局在が観測されないことから、脂質修飾依存的な局在化が起きていることが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
今年度はIn-cell NMR観測法の技術開発を行い、①細胞内におけり動的構造平衡の変調、②KO細胞を用いた細胞内制御因子の影響の抽出、③標的タンパク質の細胞内局在化について一定の成果を挙げることができた。また装置の購入などの研究環境の整備も進めることができ、今後の研究推進の環境整備を整えることができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
①細胞内構造ダイナミクス：今年度の成果に基づき、Rac1のin-cell NMRスペクトルの化学シフトやシグナルの線幅の線形解析に基づいて細胞内の動的構造情報の抽出する手法を確立する。また、分子クラウダーを用いた再構成実験により、細胞内分子混雑環境におけるRac1の自由エネルギーランドスケープの変化と対応させ、細胞内におけるRac1の活性変調を動的構造の変化に基づいて解明する。
②細胞内制御因子の影響：KO細胞を用いたIn-cell NMR観測結果を説明する数理モデルを構築し、細胞内におけるRasGAPの酵素パラメーター（Kmおよびkcat）を定量する手法を確立する。また、同定したGAP非感受性Ras変異体のkhyを促進する非典型GAP分子についてin vitroにおける活性測定を行う。
③細胞内局所環境におけるIn-cell NMR観測：細胞膜に局在化させたRasについて、質量分析やWestern blot法を用いて脂質修飾や翻訳後修飾の進行を確認する。また、細胞膜上に局在化したRasのin-cell NMR観測に取り組み、局在の有無によるGTP型割合の違いや、細胞にEGFなどの受容体刺激を添加することに伴う活性化の観測を試みる。
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